Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Как сделать липкие концы - тупыми?
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! HACTEHKA




 прочитанное сообщение 18.07.2008 13:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Нужно сделать липкие концы тупыми.
И какими ДНК полимеразами I лучше их надстраивать до тупых?

Сообщение было отредактировано HACTEHKA - 18.07.2008 13:43
guest: Андрей
IP-штамп: fr5rCDKjN1xa6
гость



 прочитанное сообщение 18.07.2008 14:07     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

А Кленов вас чем не устраивает?
Участник оффлайн! Egil
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.07.2008 14:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Возьмите PFU полимеразу. 30 минут на 72.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): petr
Guest
IP-штамп: frGqyYT8IU7LU
гость



 прочитанное сообщение 18.07.2008 14:41     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Их можно либо "достроить" , либо "подрезать". А что вам нужно? Если "достроить - то ДНК-полимеразой - вам коллеги уже присоветовали. Если подрезать - воспользуйтесь нуклеазой Р1 или S1. Все зависит от вашей задачи.
Guest
IP-штамп: frNVjPT6S76SU
гость



 прочитанное сообщение 24.07.2008 19:56     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Дорогой гость, Вы большой теоретик! Если о предмете Вам известно только из книг, пожалуйста воздержитесь от комменсов frown.gif.
Андрей +1
Egil, согласен, для ПЦР продукта достаточно и 5 мин.
Guest
IP-штамп: frWv/19onoXiA
гость



 прочитанное сообщение 24.07.2008 23:27     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Все тупят, тупят, тупят, тупят, тупят, тупят, тупят, тупят...., хотел сказать, что
вопрос про липкие концы и причем тут ПЦР продукт... confused.gif
Участник оффлайн! The problem
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 24.07.2008 23:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

все просто, это написано в любом аппендиксе каталога NEB. Если достроить после рестрикции 5'- выступающий- берете Кленов, если съесть 3'-выступающий (достроить нельзя)- то Т4-полимераза. никаких S1 и прочего говна, они Вам такого наворотят. Тупить надо при комнатной темп., буквально 3, много 5 мин, не больше, ибо всякие простройки ников дадут Вам такую "мохнатую" матрицу, что будут проблемы при клонировании. Добавляете букв как в ПЦР, это с избытком, но их не жалко, 1 мкл фермента, 3 мин, и сразу в фенол. В любом рестриктном буфере, условия, понятно, субоптимальные, но надо-то всего 2-4 буквы достроить/съесть, это не big deal
Guest
IP-штамп: frTITTs62W.JQ
гость



 прочитанное сообщение 07.08.2008 10:48     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Помогите достроить липкие концы pfu, сколько чего и какие условия необходимы? mol.gif
Большое спасибо за помощь cool.gif
Участник оффлайн! The problem
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 07.08.2008 12:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

не надо Pfu, просто добавьте в ПЦр Т4-пол, как я писал выше (букв можно немного добавить) 1-2 ед на 50 мкл реакции, 5 мин на столе, и все. Для Pfu по классике требуется добавить свой буфер, буквы и фермент, потом 30 мин на 70оС (так написано у Stratagene, по крайней мере, в ките для лигирования с помощью Srf I по тупым концам- что естественно, фирма предлагает свои полимеразу и рестриктазу)

Сообщение было отредактировано The problem - 07.08.2008 12:38
Guest
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 07.08.2008 12:53     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(The problem @ 07.08.2008 11:37)
Ссылка на исходное сообщение  не надо Pfu, просто добавьте в ПЦр Т4-пол, как я писал выше (букв можно немного добавить) 1-2 ед на 50 мкл реакции, 5 мин на столе, и все. Для Pfu по классике требуется добавить свой буфер, буквы и фермент, потом 30 мин на 70оС (так написано у Stratagene, по крайней мере, в ките для лигирования с помощью Srf I по тупым концам- что естественно, фирма предлагает свои полимеразу и рестриктазу)

С Pfu тупить, я думаю, надо уметь - был случай у меня когда Pfu cо свистом объедал 3-конец и делал 5-торчащий липкий. Также Pfu портил мне зашпиленные праймеры (тупой конец). Т4 ДНК полимераза yes.gif и не открывайте америку. Проблемник прав.
Guest
IP-штамп: frTITTs62W.JQ
гость



 прочитанное сообщение 08.08.2008 11:30     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

поясните, что делать с фенолом?
После того, как я достроил и добавил фенол, что делать дальше? Если я хочу еще рестрицировать, мне нужно переосодить ДНК?
Guest
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость



 прочитанное сообщение 08.08.2008 12:45     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(Guest @ 08.08.2008 10:30)
Ссылка на исходное сообщение  поясните, что делать с фенолом?
После того, как я достроил и добавил фенол, что делать дальше? Если я хочу еще рестрицировать, мне нужно переосодить ДНК?

Надосадок (супернатант) переносите в чистую пробирку для осаждения спиртом, а фенол остается в пробирке, которую закрывете и в мусор.
Может быть порежется без очистки, попробуйте... confused.gif
Участник оффлайн! The problem
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.08.2008 20:10     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

фенол-хлороформ, разумеется? Непременно переосадить с добавлением соли, как обычно. Следы фенола- не гууд
Guest
IP-штамп: fryZ/qrb5F46U
гость



 прочитанное сообщение 09.08.2008 20:36     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(Guest @ 08.08.2008 10:30)
Ссылка на исходное сообщение  поясните, что делать с фенолом?
После того, как я достроил и добавил фенол, что делать дальше? Если я хочу еще рестрицировать, мне нужно переосодить ДНК?


Я после 5ти минут на столе (Т4 полимераза с буквами) просто ставлю 20 минут на +70С, потом в лед, и добавляю вторую рестриктазу, без фенола.
Участник оффлайн! The problem
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.08.2008 13:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

ОК, так тоже хорошо, но не дай бог, не все умрет...К тому же, за 20 мин я 2 раза отфенолить успею- посему, быстрее очистить, чем судьбу искушать.
Участник оффлайн! HACTEHKA




 прочитанное сообщение 20.01.2009 14:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

Нужно сделать из 5' - концов тупые путем обрезания нуклеазой S1 (надстроить не получиться, так как нарушится рамка считывания).
Подскажите, пожалуйста, как подобрать оптимальные условия для S1, что бы она не съела лишнее?
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.01.2009 16:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

я бы не стал упражняться с S1, много клонов лопатить придется, пока найдете один с нужной рамкой, лучше подумайте над изменением схемы клонирования, почти всегда можно найти что-нибудь поизящнее, чем S1
Участник оффлайн! Odysseus
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.02.2009 20:44     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

Можно ли использовать PFU полимеразу для получения тупых концов, если требуется переклонировать фрагмент длиной 2700 в вектор длинной 11000. При этом необходимо сделать тупыми липкие концы как у вставки, так и у вектора. Вектор для трансформации растений. Сбоя рамки быть не может, т.к. клонируемый фрагмент предназначен для подавления экспрессии гена по механизму РНК интерференции.


Проще говоря, возможны ли проблемы при дальнейшей работе с полученным вектором из-за обработки PFU полимеразой? (А то меня тут пугают smile.gif)

P.S. Других ферментов у меня просто нет frown.gif .

Заранее спасибо за ответ.

Сообщение было отредактировано Odysseus - 11.02.2009 20:51
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 11.02.2009 22:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

2700 в 11000 вектор втупую вы можете клонировать лет эдак 10)))
Участник оффлайн! Odysseus
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.02.2009 13:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

(ship @ 11.02.2009 22:18)
Ссылка на исходное сообщение  2700  в 11000 вектор втупую вы можете клонировать лет эдак 10)))


Один раз уже получилось, правда тупой был только один конец. smile.gif
Сейчас, один из двух сайтов рестрикции вставки подходит к сайту вектора. Я хочу вырезать фрагменты, лигировать по одному из сайтов, потом "затупить" и лигировать с другой стороны в тупую.
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 12.02.2009 15:53     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

Зиллион годных универсальных способов, т-4ка, стрэндаза итэпэ, я обычно использую сие вкупе с кленовым щоб не отжирало лишнее. Можно немного потитровать...

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): petr
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.02.2009 18:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

klenov лишнего не сожрет в присутствии букв, пустые страхи. Да и Т4 тоже, все же это полимераза на минуточку, а не екзонуклеаза

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): petr
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.02.2009 18:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

(Odysseus @ 12.02.2009 13:59)
Ссылка на исходное сообщение  Один раз уже получилось, правда тупой был только один конец. smile.gif
Сейчас, один из двух сайтов рестрикции вставки подходит к сайту вектора. Я хочу вырезать фрагменты, лигировать по одному из сайтов, потом "затупить" и лигировать с другой стороны в тупую.

так не выйдет- нарисуйте, подумайте, поймете (может) почему.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Odysseus
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 13.02.2009 16:45     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

КленОв не жрёт 5' оверхэнги - ему нечем. А т-4ка это такая странная штука и жрёт чо ни попадя когда не надо. Потому иё сдерживать надо. Ядерным сдерживателем lol.gif
Участник оффлайн! Odysseus
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.02.2009 21:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

(RJ Dio @ 12.02.2009 18:53)
Ссылка на исходное сообщение  так не выйдет- нарисуйте, подумайте, поймете (может) почему.

Да, вижу. Видимо, не покатит. Спасибо. Буду думать дальше до понедельника. Уж больно не хочется делать два последовательных клонирования. smile.gif
бобр
IP-штамп: frDQwa9k7riYg
гость



 прочитанное сообщение 14.03.2011 16:55     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

А можно вместо т4 полимеразы использовать так эс е? вроде тоже 3'-5' экзонуклеазной активностью обладает, тэ-4 просто нету
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 15.03.2011 10:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

Taq юзать можно, Стратаген так и предлагает в своих китах по тупому лигированию с Srf I. Однако мне кажется это менее технологичным, нежели мезофильную Т4 использовать. Аккуратнее выходит. Кстати, особых страстей при работе с Т4 не наблюдаю. Надо просто 2-3 мин, на столе и в присутствии буковок, чтоб не сожрала чё ни попадя. Главное- не передерживать и сразу убирать после реакции. 2 мин- и на колонку. Будет счастье определенно. Много раз секвенировал места стыка, полученные именно таким путем- все Ок, буква в букву

Сообщение было отредактировано RJ Dio - 15.03.2011 10:57
Участник оффлайн! katarina




 прочитанное сообщение 27.11.2011 20:15     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

(RJ Dio @ 20.01.2009 17:38)
Ссылка на исходное сообщение  я бы не стал упражняться с S1, много клонов лопатить придется, пока найдете один с нужной рамкой, лучше подумайте над изменением схемы клонирования, почти всегда можно найти что-нибудь поизящнее, чем S1

А Т4 полимераза не сможет 5-выступающий отгрызть?
Участник оффлайн! RJ Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 28.11.2011 14:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

c 5' никто не работает, кроме киназы, пора азы науки знать

Сообщение было отредактировано RJ Dio - 28.11.2011 14:55
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  11.12.2021 11:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

https://wanelo.co/replicarolexwatches
https://musescore.com/fakerolexwatches
https://www.racked.com/users/Replicarolexwatches
https://sketchfab.com/Rolexrelicawatches
http://www.video-bookmark.com/bookmark/433...eplica-watches/
https://www.slideserve.com/ReplicawatchesUK...pt-presentation
https://www.theverge.com/users/Replicarolexwatches
https://www.yumpu.com/en/document/read/6532...lica-watches-uk
https://online.flippingbook.com/view/152275247/
https://www.instapaper.com/p/8767342
https://www.bigblueview.com/users/Replicarolexwatches
https://weheartit.com/watcheshutuk
https://sites.google.com/view/replicarolexwatches24/home
https://www.indiehackers.com/post/hints-on-...atch-113aef73a9
http://replicawatchesuk.esportsify.com/for...ica-rolex-watch
guest: Madyson
IP-штамп: frYUDxQtTmM0s
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  17.05.2022 22:32     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

Madyson
nigoal123
IP-штамп: frAWeMdOsBSXM
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  18.05.2022 09:26     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование

As with all writing บาคาร่าออนไลน์ the language should be slot xo suitable for the audience. 11hilo the language will need to be สล็อต While each has specific 123GOAL easy for that age group to understand

but also exciting and lively nigoal enough to make them ลิงค์รับทรัพย์ common characteristics. พ ริ ต ตี้ เกม มิ่ง want to read it. ราคา บอล Each section has a heading Hotgraph that outlines the main topic

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 18:49
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft