Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Заморозка фибробластов
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Peppermint




 прочитанное сообщение 06.06.2019 13:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Добрый день. При работе с культурой клеток фибробластов возникла следующая проблема: клетки плохо переносят заморозку, при размораживании жизнеспособность культуры стремится к нулю. Были опробованы разные смеси для заморозки: 45% сыворотки, 45% ДМЕМ, 10% ДМСО; 90% сыворотки, 10% ДМСО; 90% ДМЕМ, 10% ДМСО. Предполагаем, что проблема имеет место быть именно на этапе заморозки. Заморозка клеток осуществляется следующим образом: клетки снимаются с планшета, центрифугируются, к осадку клеток добавляется 1 мл охлажденной смеси для заморозки. Концентрация клеток в 1 мл примерно 900 тысяч-1 миллион. Далее криопробирка с клетками помещается в пенопластовый контейнер и в холодильник (+4) на 15 минут, затем в морозилку (-20) на два часа, и далее в низкотемпературный холодильник (-47, на -80 морозильной камеры нет). Через 24 часа клетки опускаются в жидкий азот. Подскажите, пожалуйста, возможно, ошибка в том, что держать клетки сутки в температуре -47 является недопустимым?
Участник оффлайн! Asterix
Участник



 прочитанное сообщение 06.06.2019 13:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Вы абсолютно правы .. если у вас нет -80, то попробуйте сразу на лед , ну пока дойдете до дьюара с азотом они и охладятся во льду и в жидкий азот, без вот этих охлаждений на +4 и -20, ... и все получится .. Ну 70% уж точно будет жизнеспособность.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Peppermint
Участник оффлайн! Vadim Sharov
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 06.06.2019 13:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Попробуйте на 3 часа на -47.
Но мне кажется, проблема в -47, а не в 24 часах. Может - 47 и азот слишком крутой переход.
Участник оффлайн! Peppermint




 прочитанное сообщение 06.06.2019 13:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

(Asterix @ 06.06.2019 14:18)
Ссылка на исходное сообщение  Вы абсолютно правы ..  если у вас нет -80,  то попробуйте  сразу  на лед  , ну пока дойдете  до дьюара  с азотом они и охладятся  во льду  и  в жидкий азот, без  вот этих охлаждений  на  +4  и  -20,  ... и все получится ..  Ну 70%  уж точно будет жизнеспособность.




Спасибо Вам большое за ответ!
Участник оффлайн! Peppermint




 прочитанное сообщение 06.06.2019 13:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

(Vadim Sharov @ 06.06.2019 14:24)
Ссылка на исходное сообщение  Попробуйте на 3 часа на -47.
Но мне кажется,  проблема в -47, а не в 24 часах. Может - 47 и азот слишком крутой переход.



Тогда попробуем оба варианта: одну пробирку сразу в лед и потом в азот, вторую на пару часов на -47, а далее в азот.
Участник оффлайн! Vadim Sharov
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 06.06.2019 22:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Есть третий вариант. В пенопластовую коробку наливаете жидкий азот. Пускаете CO2. Он в коробке становится сухим снегом в - 80 (-78,5 для педантов). Вот Вам и необходимая морозильная на -80. Туда коробочку с клетками на 1,5 - 2 часа. Требуемые 1 градус в минуту. Без промежуточных проморозок. С + 4 (это у вас температура смеси) в контейнер для замораживания и в коробку с сухим льдом. Потом в ж. азот.

Открою тайну: сухой лед в термоконтейнере можно купить (хотя коробку найти легко, на термоконтейнере можно съэкономить), про баллон с газом напомнил любителю биохакинга, или вдруг Вы в лесу замораживаете фибробласты чукокабры.

Набиваете "сухой лед купить" и будет Вам счастье. https://polus-holoda.ru/
Участник оффлайн! Asterix
Участник



 прочитанное сообщение 07.06.2019 00:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Ну Шаров , мимо моего забора без шуток не ходите ...

Что значит нет -80? Да в любом Боинге и Эйрбасе стоят такие компактные морозильники малого размера , в них компьютеры охлаждаются и сотвественно на Е-бае их полно старых но вполне рабочих еще , и совсем недорого , кому они нахрен нужны еще , а там надежность сами понимаете , для авиации делали.

Мы, биохакеры-подпольщики, именно их используем .. когда нам нужно -80 вот позарез.

Там внутрений обьем - это стандартный компьютерный ящик, идеально решает все проблемы .. одному человеку большего обьема и не надо для работы.
Участник оффлайн! Asterix
Участник



 прочитанное сообщение 07.06.2019 00:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

https://scontent-bru2-1.xx.fbcdn.net/v/t1.0...6a3&oe=5D82C915

это холодная баня ... очень старинный агрегат... Ну или скажем так специализированный ... видимо на научной барахолке по-дешевке взяли, когда какая-то биотехкомпания разорилась.

Прям как у нас ... такие потрясающие инвентарные номера висят на нашем старье , ... иных уж нет, а те далече. Один ИнноГенетикс чего стоит ...
Участник оффлайн! kenseq
Участник



 прочитанное сообщение 09.07.2019 17:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

акренет вы форум случайноно не перепутали это к дяде факсеру клеточные технологии eek.gif eek.gif confused.gif eek.gif confused.gif
Участник оффлайн! Кузбассовец




 прочитанное сообщение 14.07.2019 02:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Погрузите пробирки в контейнер с изопропанолом, и сразу отправляйте на -47. В изопропаноле скорость охлаждения - 1 градус в минуту smile.gif smile.gif smile.gif
Участник оффлайн! kenseq
Участник



 прочитанное сообщение 14.07.2019 20:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

позвоните в питер в ЦИН РАН smile.gif
Институт цитологии Российской академии наук Тихорецкий проспект 4 Санкт-Петербург 194064 Россия. Телефон: +7 (812) 297-18-29 +7 (812) 297-18-29.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 15.07.2019 01:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

топик стартер - а напишите как вы их размораживаете. почему вы думаете что дело в заморозке?
главное правило -медленно замораживаем, быстро оттаиваем.
моя обычная заморозка - поставил ампулу в пенопластовую коробочку и на -70С.
если у вас -47С - то не думаю что это так сильно влияет. особенно если вы их там долго не держите и сразу убираете в азот.
а вот вся эта фигня с +4С , -20С и тп - вот этого вот не надо точно. даю вам 100%.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Peppermint
Участник оффлайн! kenseq
Участник



 прочитанное сообщение 15.07.2019 08:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(ship @ 15.07.2019 02:36)
Ссылка на исходное сообщение 
главное правило -медленно замораживаем, быстро оттаиваем.



шип если про вотку то да beer.gif

шип фибры заморозит разморозит куня попробуй гибридомы с моноклонами smile.gif

шип не хочу открыват новую тему

пачаму после размарозки гибридом не дают выхлоп моноклоналных антитеl хотйя растут
ссуки smile.gif
Участник оффлайн! Peppermint




 прочитанное сообщение 19.07.2019 09:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(kenseq @ 09.07.2019 18:31)
Ссылка на исходное сообщение  акренет вы форум случайноно не перепутали это к дяде факсеру клеточные технологии  eek.gif  eek.gif  confused.gif  eek.gif  confused.gif


Если даже и перепутала по причине недавней регистрации на сайте, не думаю, что это меняет суть вопроса. Тему либо переместят, либо мне самой нужно это сделать каким-нибудь образом.
Участник оффлайн! Peppermint




 прочитанное сообщение 19.07.2019 09:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

(Кузбассовец @ 14.07.2019 03:36)
Ссылка на исходное сообщение  Погрузите  пробирки в контейнер с изопропанолом, и сразу отправляйте на -47. В изопропаноле скорость охлаждения - 1 градус в минуту smile.gif  smile.gif  smile.gif


Благодарю за совет!
Участник оффлайн! Peppermint




 прочитанное сообщение 19.07.2019 10:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

(ship @ 15.07.2019 02:36)
Ссылка на исходное сообщение  топик стартер - а напишите как вы их размораживаете. почему вы думаете что дело в заморозке?
главное правило -медленно замораживаем, быстро оттаиваем.
моя обычная заморозка - поставил ампулу в пенопластовую коробочку и на -70С.
если у вас -47С - то не думаю что это так сильно влияет. особенно если вы их там долго не держите и сразу убираете в азот.
а вот вся эта фигня с +4С , -20С и тп - вот этого вот не надо точно. даю вам 100%.



Сначала криопробирки достаются из жидкого азота и опускаются в водяную баню (+37С). Пробирки с замерзшей средой не полностью погружены в теплую воду, где-то наполовину, и среда отогревается до момента, пока в ней не остается плавать маленький кусочек льда. Далее, оттаявшая суспензия клеток помещается либо в культуральный флакон с 15-ю мл теплой среды (с учетом того, что объем замороженной суспензии клеток составлял 1 мл) и убирается в инкубатор, либо же оттаявшая суспензия центрифугируется, супернатант сливается и клетки так же помещаются во флакон. На следующий день среда заменяется, но, чаще всего, выживших либо нет, либо критически мало.
Предполагаем, что дело в заморозке, потому что разморозку делали по инструкции к клеткам с сайта "спутник".
Спасибо большое за совет, попробуем все без стадий на +4 и -20С.

Сообщение было отредактировано Peppermint - 19.07.2019 10:29

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 18.08.19 15:06
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft