Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* вопрос по qPCR
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Aleksis17




 прочитанное сообщение 14.06.2017 14:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Колллеги! очень нужен совет бывалых новичку.
две разные реакции, обе на Су5.
1. 95-3' (95-15'', 61-1')x40
2. 95-3' (95-15'', 58-45'')x40
по цифрам все нормально, но почему такой низкий RFU?
с другими красками проблем нет

Картинки:
 картинки уже нет на сайте: 1.jpg 1.jpg — (154.19к) 14.06.2017 — 14.12.2017  
 картинки уже нет на сайте: 2.jpg 2.jpg — (151.86к) 14.06.2017 — 14.12.2017  
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 14.06.2017 15:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Прогнать реакции на другом CFX циклере. Если RFU будут выше - дело в циклере, а если останутся такими же - в кривом Cy5 флюорофоре (флюоресцентных пробах).
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 14.06.2017 16:33     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Похоже на то, что ошиблись концентрацией зонда в 5-10 раз.
Синтезируйте зонд в другой фирме. На самом деле на CFX Cу5 светит в своем канале в несколько раз сильнее чем тот же FAM в эквимолярных количествах.
Участник оффлайн! Horse-radish
Участник



 прочитанное сообщение 14.06.2017 16:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Если не секрет, напишите в личку кто есть производитель данных зондов.
Участник оффлайн! 13ZC




 прочитанное сообщение 14.06.2017 17:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

У вас по другим каналам есть что-нибудь?
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 14.06.2017 17:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

(-Ъ- @ 14.06.2017 14:33)
Похоже на то, что ошиблись концентрацией зонда в 5-10 раз.
Синтезируйте зонд в другой фирме. На самом деле на CFX Cу5 светит в своем канале в несколько раз сильнее чем тот же FAM в эквимолярных количествах.

Наврядли они ошиблись с концентрациями проб в двух разных экспериментах. Однако, если обе пробы заказаны от одного производителя, тогда обе могут быть кривыми. Интересно, когда в России станут называть TaqMan probes пробами (как в всём остальном мире), а не зондами?
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 14.06.2017 18:03     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(Carbon Copy @ 14.06.2017 18:42)
Ссылка на исходное сообщение  Наврядли они ошиблись с концентрациями проб в двух разных экспериментах. Однако, если обе пробы заказаны от одного производителя, тогда обе могут быть кривыми. Интересно, когда в России станут называть TaqMan probes пробами (как в всём остальном мире), а не зондами?

А немцы на своем родном знаете как их называют? tongue.gif
Так что уже поздно, немцы опередили англичан.
Участник оффлайн! Aleksis17




 прочитанное сообщение 15.06.2017 15:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Всем спасибо за ответы!
Все таки грешу на качество проб. Заказаны были у одного производителя, но в разное время.
Участник оффлайн! avial
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.06.2017 22:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

А эти же последовательности зондов работали лучше с этим или другими красителями? Или это первый эксперимент с ними?
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.06.2017 20:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Напишите, пожалуйста, кто делал. Может кому будет полезна такая информация smile.gif
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 22.06.2017 10:57     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

С большим уважением отношусь к химикам - ну не могут они ошибиться с концентрацией на порядок. А плохое мечение регистрируется и отсекается на стадии очистки.
Стрелочник ошибся! smile.gif при разбавлении.
Последовательности ЗОНДА (для Карбоныча) и праймеов в студию!
Может быть зонд у Вас сопливый (короткий, зашпиленный), а может быть даже дело в горбатых праймерах.
Но по виду кривых (накоплению сигнала) зонд работает прилично, но мало светит.
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 22.06.2017 15:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

может быть даже дело в горбатых праймерах

раститровка, по крайней мере, нормальная

есть фраза
с другими красками проблем нет
, но не понятно, это одинаковые зонды на разных красках или разные зонды. Думаю, тут это ключевой момент.
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 22.06.2017 19:11     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(kblag @ 22.06.2017 16:47)
Ссылка на исходное сообщение  раститровка, по крайней мере, нормальная

есть фраза , но не понятно, это одинаковые зонды на разных красках или разные зонды. Думаю, тут это ключевой момент.

Ошибиться при приготовлении серии разбавлении - это надо постараться. no.gif
Я имел ввиду то, что зонд изначально был разбавлен, т.е. написано 10 мкМ, а там реально 1.
А зачем один и тот же зонд метить разными красками?
Не знаю, видимо большой наукой занимается чел.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Bern5
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 23.06.2017 14:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Ошибиться при приготовлении серии разбавлении - это надо постараться. no.gif

это я к тому, что если праймеры совсем кривые то эффективность реакции по раститровке ДНК будет низкой

А зачем один и тот же зонд метить разными красками?

могли изначально сделать FAM, потом решили засунуть в мультиплекс и перекинули на Cy5

Вообще изначально выбор Cy5 не совсем стандартен, если это не мультиплекс
Участник оффлайн! Aleksis17




 прочитанное сообщение 28.06.2017 10:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

коллеги!
отвечаю сразу на все вопросы.

первый эксперимент TMTRI,f CAGCAGMTRCTCAAGGTAGACCC; TMTRI,r AACTGTAYACRACCATGCCAAC; TMTri,p Cy5-AGCTTGGTGTTGGGATCTGTCCTTACCG -BHQ2
95° for 3 min; [95° for 15 s; 60° for 60 s]×40. взято отсюда:
Yli-Mattila T, Paavanen-Huhtala S, Jestoi M, Parikka P, Hietaniemi V, Gagkaeva T, Sarlin T, Haikara A, Laaksonen S, Rizzo A (2008) Real-time PCR detection and quantification of Fusarium poae, F. graminearum, F. sporotrichioides and F. langsethiae in cereal grains in Finland and Russia. Arc Phytopathol Plant Protect 41(4):243–260. doi: 10.1080/03235400600680659
коллеги говорят, что эта реакция всегда хорошо работала, но это было до моего прибытия в количественный анализ

второй эксперимент fum1_fw ATGCAAGAGGCGAGGCAA;
fum1_rev GGCTCTCAGAGCTTGGCAT; fum1_probe CY5-CAATGCCATCTTCTTGAAACCT-BHQ2. 95° for 15 min; [95° for 15 s; 58° for 45 s]×40. отсюда
Preiser et al Development of a multiplex real-time PCR to quantify Fusarium DNA of trichothecene and fumonisin producing strains in maize // Anal. Methods, 2015 DOI: 10.1039/C4AY02581D

все праймеры и пробы заказаны в питерском Beagle, но в разное время, стоки разводились согласно паспортам. ошибка в разведении стока на порядок была бы видна невооруженным глазом. рабочие растворы постоянно обновляются - результат тот же.
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 28.06.2017 13:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

А зачем Вы делаете зонды на Cy5?
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 29.06.2017 14:48     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

Олиги канешна не фонтан, особенно прямой праймер из первой системы (на 3-штрих конце -ССС - это слишком рискованно) и зонд из второй (короткий и сопливый, как раз под 58 град.), но работать можно, если реактивы качественные, с горячим стартом и т.д. ...
Тогда остается грешить на плохой синтез или развал зонда при хранении - 70-80% зонда потеряли метку или часть зонда вышел без метки при синтезе, если такое возможно.
Звоните непосредственным исполнителям, синтезируйте на другой фирме.
Повторюсь, Су5 наоборот светится в несколько раз сильнее чем другие краски.
А может у меня чудомастермиксы. wink.gif
Участник оффлайн! Aleksis17




 прочитанное сообщение 29.06.2017 15:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

(kblag @ 28.06.2017 14:59)
Ссылка на исходное сообщение  А зачем Вы делаете зонды на Cy5?

для мультиплекса
Участник оффлайн! Horse-radish
Участник



 прочитанное сообщение 29.06.2017 15:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

(-Ъ- @ 29.06.2017 12:48)
Ссылка на исходное сообщение  Повторюсь, Су5 наоборот светится в несколько раз сильнее чем другие краски.


Прям уж в разы сильнее? На каком циклере ставите?
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 29.06.2017 15:39     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

(Horse-radish @ 29.06.2017 16:22)
Ссылка на исходное сообщение  Прям уж в разы сильнее? На каком циклере ставите?

Да, в разы. Экономлю Cy5, ROX и VIC выравнивая с FAM в мультиплексе.
На CFX96, как раз по теме.
Но эта тенденция наблюдается на всех приборах, даже на флуориметрах (Gene, Tecan).

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): ржу громко
Участник оффлайн! kblag
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 29.06.2017 19:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

Да, в разы. Экономлю Cy5, ROX и VIC выравнивая с FAM в мультиплексе.

Подтверждаю, Cy5 светит отлично.
Я бы пересинтезировал.

Ещё можно посмотреть кривые без вычитания фона. При плохом синтезе может быть фон начальный высокий.

Сообщение было отредактировано kblag - 29.06.2017 19:27
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  23.11.2021 15:15     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

http://replicarolexwatches.simpsite.nl/
https://www.smore.com/rj7kh-best-replica-watches
https://www.athleticsnation.com/users/Replicarolexwatches
https://pastebin.pl/view/ab0e458a
https://mix.com/watcheshutukcom
https://www.woddal.com/post/359216_tiny-acc...nybody-039.html
https://share.naturalnews.com/posts/3904099
https://demo.wowonder.com/post/214429_the-i...-producers.html
https://rapichat.com/post/5369_our-purpose-...ible-there.html
https://dashburst.com/replicarolexwatches/1
https://sway.office.com/KifcQvn36MK821G8
https://flipboard.com/@replicarolex24
https://getpocket.com/redirect?url=https%3A...eshut.uk.com%2F
https://www.openstreetmap.org/user/Hints%20...20Rolex%20Watch

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 19:08
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft