molbiol.ru -> HPLC dlja razdelenija proteinow kto Primenjal?

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* HPLC dlja razdelenija proteinow kto Primenjal?

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Alexej Dronov
Участник

21.08.2002 16:43

URL #1

Nuzno razdelit proteini iz zelez komara i chtobi raznica mezdu frakcijami ne sostawljala bolse 50 KDalon. Sowetujut HPLC. Chto skazut specialisti?

Olezhek
Постоянный участник
Tsukuba, Japan/КФУ, РФ

21.08.2002 17:15

URL #2

у нас было все хуже... мы 30 и 32 пытались разгонять...

Alexej Dronov
Участник

21.08.2002 17:40

URL #3

Ну и разогнали?

[Текст переведён с транслита]

Andrei
Постоянный участник

21.08.2002 19:34

URL #4

Alexei,
Did not understand your first posting quite well. You need to do the SIZE separation of proteins?
[Текст переведён с транслита]

ALT
Постоянный участник

22.08.2002 06:26

URL #5

Ничего не понял, а какой диапазон белков. Если индивидуальные глобулярные белки, то они редко превышают 200 кда, Вам нужно поделить на 4 фракции?. Так для этого HPLC. Это можно сделать вообще без хроматографии на ультрамембранах.
Но вообще, чтобы дать нормальный совет необходимо знать: диапазон масс белков, количество образца и ориентировочную концентрацию тотального белка в пробе. Это минимальная информация.

Olezhek
Постоянный участник
Tsukuba, Japan/КФУ, РФ

22.08.2002 07:26

URL #6

разогнали, но это все было после FPLC , ion-exchange, reverse-phase и гель-фильтрации, если я не путаю;(

ALT
Постоянный участник

22.08.2002 10:30

URL #7

Чем же это Вы еще растаскивали 30 и 32 после гель-фильтрации?

Olezhek
Постоянный участник
Tsukuba, Japan/КФУ, РФ

22.08.2002 14:20

URL #8

нееет...просто из геля не вырезали (что было бы логичнее)..
а аминокислотный состав после HPLC определи.. вот сейчас и страдаю - читали смесь 30 и 32 (без меня делали, на вопрос почему раздельно не определяли молчат).. состав аминокисллотный одинаков, но есть дополнительная маленькая пептидная цепочечека.. которая дисульфидными мостиками цепляется..
коллеги, а реально работать с пептидиком вырезанным из геля на предмет чтения а/k последовательности или там активности его (пептида)?

ALT
Постоянный участник

22.08.2002 20:54

URL #9

Последовательность нет проблем, а с активностью не всегда, в смысле если форез с меркаптоэтанолом и мочевиной, то может и потерять активность.

Alexej Dronov
Участник

23.08.2002 01:56

URL #10

Проба:Экстракт или измельченные слюнные железы комара
Количество: 10-300 миллиграмм
Необходимо: сепарация по размеру *чем меньше разница в размере фракций тем лучше.
Для чего:определить на какие из фракций в функциональном тесте ин витро базофилы реагируют максимальным релизом гистамина.
Конечная цель:рекомбинантные протеины.
Всем заранее благодарен.

23.08.2002 03:26

URL #11

Алексей,
Если вам нужны индивидуальные белки, то на гель-фильтрацию (хотя бы и на HPLC) не заморачивайтесь. Слишком много белков. Этот метод используют для смесей, где число компонентов исчисляется единицами. Ну а если просто по радиусам растащить, не выделяя индивидуальные, то запросто.
Далее, если Вам нужны нативные белки, то лучше для начала ионообменку на FPLC попробовать. Или у Вас в милиграммах масса желез (что вероятнее)?
Если сойдут и денатурированные, то можно на SDS-форезе градиентном, а потом экстрагировать (красить имидазолом, как здесь, на сайте, описано). Можно еще градиентный нативный форез попробовать, но там часть белков всегда будет плыть не в нужном направлении, соответственно потери.

Andrei
Постоянный участник

23.08.2002 04:09

URL #12

#Alexej,
10-300 миллиграмм-это количество чего-белка? или же это тотальная масса желез? Если последнее, какова всё-таки ориентировочная концентрация тотального белка в пробе? (Повторяю вопрос, заданный ALT).
Второй вопрос-какая приборная база Вам доступна? Если у Вас в лаборатории или у соседей, или у знакомых и т.д. имеется система для хроматографиии типа FPLC, задача намного упрощается.
Третий вопрос-Вы уверены, что базофилы в Вашем тесте изначально реагируют на белки? Может, это что-то небелковое и низкомолекулярное в экстракте желез?
Классически, подобное проверяется добавлением протеазы ( например трипсина) в образец. Однако, если Вы этого ещё не сделали, имеет смысл провести следующий тест: взять колонку Pharmacia PD-10, уравновесить её нужным Вам буфером (так как растворённые в нём вещества будут использоваться в тесте с базофилами, этот буфер не должен быть для них токсичен или вызывать неспецифический выброс гистамина). Промойте колонку буфером очень тщательно, 20-30 объёмов, так как PD-10 поставляются в чём-то типа мертиолата и из Сефадекса может выделяться куча всякой дряни.
Нанесите на колонку 1 мл экстракта, элюируйте её Вашим буфером, и соберите фрвкции:№1-3.3 мл, №2-1.5 мл, №3-1.5 мл, №4-1.5 мл. №5- 4 мл. Первая фракция-это свободный объём, её можно отбросить. Все белки до 4-5 килодальтон и другие высокомолекулярные вещества выйдут во фракциях 2 и 3 плюс "хвост" во фракции 4. В принципе, некоторые белки могут неспецифически адсорбироваться на колонке и выйти позже. Низкомолекулярные вещества будут во фракциях 4 и ( в основном) 5.
Протестируйте фракции 2-5 и сравните их СПЕЦИФИЧЕСКУЮ активность с тем, что Вы нанесли на колонку. Важно именно специфическую, так как нужно чётко представлять себе, сколько единиц активности Вы нанесли и сколько собрали. В этом бизнесе выделения активных веществ из сложных смесей часто бывает, что активность "куда-то девается" после очередной хроматографии, или начинает "делиться на пики", то есть обнаруживается в нескольких несоседних фракциях, или Вы нанесли скажем 100 единиц, а собрали 10-где остальное? Сидит на колонке?? В Вашем случае я не удивлюсь, если и высокомолекулярная и низкомолекулярная компоненты экстракта обладают нужной Вам активностью.
Если существенная активность обнаруживается в высокомолекулярных фракциях, то их нужно объединить, сконуентрировать и дальше разделять на какой- нибудь готовой гель-фильтрационной колонке фирмы Pharmacia (их несколько разных типов). Если у Вас (или соседей) уже есть какая-то из них в комплекте с FPLC-дайте знать, что именно.#

ALT
Постоянный участник

23.08.2002 21:12

URL #13

Если нужно определится, с молвесом активных веществ, то не заморачивайтесь FPLC, это конечно круто, но не очень стандартно. Еще раз, возьмите более менее стандартные мембраны. Скажем 10 кда, 40 кда, 100 кда. На центрифужке, через них продавите, определите фракцию по биологической активности. И дальше все будет воспроизводится и через год и через два. (У FPLC, не смотря на все заверения, теперь уже амершама, вы такой стандартности не получите). А дальше, определившись с мол весом можно раскладывать пасьянс дальше.
Андрей (я уж по русски) точно говорит, что базофифильную активность может вызывать и низко и высокомолекулярные фракции, тогда это скорее всего гомополимер с длинным мономером, что кстати встречается среди насекомых. Короче длинные пептиды, сшитые между собой, иногда с модификациями в боковых радикалах. Если это так, то требуемое разрешение для Вас, где то около 2 кда, но для начала ионка, обращенка (обычно все эти фрагменты с разным молвесом не делятся этим методом, поскольку гомологичны и не очень отличаются по заряду и гидрофобности), а потом уже форез или гельфильтрация. Короче огребетесь по полной программе и не известно, хватит ли у Вас чувствительности. Это к вопросу о тотальном белке.

f1dark
Постоянный участник
Lahore, Punjab, Pakistan

01.10.2022 14:48

URL #14

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.