Rambler's Top100
Lo-Fi Version* Virtual  Russian keyboard  Russian  
Molbiol.ru | Project | Protocols | Programs | Literature
Web | Companies | Marketplace | Labor exchange

Today's active topics  [ Log In* | Register* ]  
   



Forum: 
 

Click to add to Selected Topics* Определение концентрации белка (Брэдфорд; Лоури) -- deleted by avor --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Topic related to: Методы Мерион Брэдфорд и Лоури
Options: I want to be curator* · Track this topic* · Email this topic · Print this topic*
Topic view:* Outline · [ Standard ] · Linear+


pages (4): < 1 2 3 4 > 
Reply to this topicStart new topicStart Poll
User is offline! v.sheva




 old post 13.04.2011 13:03     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Скажите влияет ли рН исследуемого раствора при определении белка по Лоури?
User is offline! ajadan




 old post 27.09.2011 14:08     Report Post         Personal message  Send an e-mail

"...А претензий к методу на 280 не меньше чем к методу на 200. Им пользуются для чистых белков в основном. Для смесей так белок никто не измеряет."

Абсолютно не верно!

как раз концентрацию белка в смеси не разделенных белков лучше (точнее и быстрее) измерять на 280 ( или Кристианом Варбургом 260/280), я бы даже сказал не лучше а правильнее. (исклучения - белки без триптофана, коих довольно мало, а в смесях можно сказать нет), ели вы хоть чтото знаете о своем белке, и способны найти экстинкцию для похожих - это самый простой и точный вариант, даже если вы ничего не знаете ошибиться больше чем в 2 раза практически невозможно. (для смесей белков ошибка еще меньше)
измерения на 205 самые точные, но требуют хорошего оборудования и рук (и качественной пробоподготовки). сходу чачу им измерять конечно же нельзя. (в этой области поглощает почти все, за исключением воды, сульфатов, хуже фосыфаты, галогениды, про органику вообще молчу)
все методы с краской МЕНЕЕ точны чем предыдущие, хотя иногда и чувствительнее. И придуманы были для измерения белков в растворах с большим количеством маскирующих (поглощающих на 280 небелковых компонентов). так ошибка в 2 раза считается очень хорошим результатом smile.gif, по бредфорду, при измерении "неизвестного" белка и калибровке по БСА, ошибка 5-10 раз частое явление. (БСА вообще не рекомендуют использовать в качестве стандарта из-за его очень высокого сродства к кумаси, впрочем это относится и к овльбумину). если у вас нет стандарта белка относящегосяк тому же семейству что и ваш исследуемый, то красками пользоваться можно только в крайнем случае если никак нельзя достоверно измерять прямым поглощением в уф.
Guest
IP-stamp: frGqyYT8IU7LU
guest



 old post 14.01.2013 12:47     Report Post       

Коллеги, подскажите пожалуйста, будут ли работать Брэдфорд, Лоури, BCA, если белки разведены в р-ре 6М гуанидингидрохлорида с 2М HCl? Спасибо.
guest: ммм
IP-stamp: frwHRv5zEzGDY
guest



 old post 14.01.2013 13:59     Report Post       

А вы проверте. скорее всего нет.
Guest
IP-stamp: frb4J7h6RI.aI
guest



 old post 14.01.2013 16:51     Report Post       

Если не найдутся те, кто уже проверял - возможно, попробую. Но тоже думаю, что не будут работать. Из-за соляной к-ты. Спасибо.
User is offline! Агроном
Advanced Member



 old post 16.01.2013 14:31     Report Post         Personal message  Send an e-mail

будут ли работать Брэдфорд, Лоури, BCA


А может и сработает Лоури - так как белок там предварительно осаждается из раствора с помощью ТХУ. Поясните - что вы подразумеваете под абброй "ВСА"? Альбумин б(в)ычий что-ли?

This post has been edited by Агроном: 16.01.2013 14:33
guest: ммм
IP-stamp: frwHRv5zEzGDY
guest



 old post 16.01.2013 21:00     Report Post       

--А может и сработает Лоури - так как белок там предварительно осаждается из раствора с помощью ТХУ.

Хотел бы я видеть как ТХУК высаживает белки из 6М гуанидинийхлорида с 2М HCl
eek.gif

--Поясните - что вы подразумеваете под абброй "ВСА"? Альбумин б(в)ычий что-ли?
http://molbiol.ru/protocol/17_07.html

Number of thanks: 1These members thanked the author (1): Агроном
User is offline! rafflesia




 old post 26.09.2014 18:59     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Коллеги, скажите, будет ли метод Лоури правильно определять концентрацию белка, если в буфере есть аргинин? или аргинин все-таки исказит результат?
guest: ммм
IP-stamp: frQlBxj4iQSg.
guest



 old post 27.09.2014 06:59     Report Post       

Не должен он мешать, по идее.
guest: ммм
IP-stamp: frQlBxj4iQSg.
guest



 old post 27.09.2014 07:02     Report Post       

Неужели нельзя просто проверить: сравнить как реагирует Лоури на воду(буфер) и на раствор аргинина.
User is offline! metrim
Advanced Member
Москва



 old post 19.03.2016 01:30     Report Post         Photo  Personal message  Send an e-mail

Готовил реактив для Брэдфорда больше года назад.
Сейчас обратил внимание что на просвет в банке - какая то взвесь
Вопрос: можно ли раствор регенерировать (докапать например фосворной кислоты, фильтрануть) или только в помойку ?
холостое определение (1:1 реактив : вода) - бесцветный раствор без признаков синевы
User is offline! MMM
Advanced Member



 old post 19.03.2016 06:58     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Можете фильтрануть и сделать новую градуировку. Она может быть нехорошей. Скорее всего очень пологой, низкий коэффициент отклика. Если это так, придется все переделать. Что бы Брэдфорд долго стоял надо использовать при приготовлении краситель наилучшего качества и фосфорную кислоту тоже, DI - воду и хранить на +4оС.
User is offline! Керуак




 old post 23.04.2016 21:21     Report Post         Personal message  Send an e-mail

После ИОХ с двумя буферами (фосфатный, pH 5,3 и трис-HCl 9) мерил концентрацию по Лоури, а во фракциях минуты через две после добавления Фолина получается какая-то муть, будто капнули белой гуаши в синюю воду :< Причём в тех пробирках, которые после вымывания белков после смены буфера, так там всё нормально, мути нет. Ионообменник - ДЭАЕ целлюлоза, пропускали концентрированный медок после фильтрации через мембрану на 10 кДА. Что может давать муть?
User is offline! MMM
Advanced Member



 old post 23.04.2016 22:10     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Приведите исчерпывающий состав буферов, использованных для хроматографии и исходного буфера в котором был белок.
User is offline! Керуак




 old post 24.04.2016 09:06     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Белок был без буфера, просто в дистиллировке; фосфатный - 0,2 М, KH2PO4, pH 5,3, доводил NaOH, Трис-HCl, собственно, трис (тоже 0,2 М), доводил солянкой, pH 9

This post has been edited by Керуак: 24.04.2016 09:07
User is offline! MMM
Advanced Member



 old post 24.04.2016 09:15     Report Post         Personal message  Send an e-mail

A осадок образуется только с фосфатным буфером? попробуйте без белка пустой буфер померить. Есть предположение по поводу фосфата.
User is offline! Керуак




 old post 24.04.2016 09:39     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Ну, в общем, как получается. Я первый раз провёл хроматографию, как только забил колонку, промывал буфером (тоже фосфатным) с pH 7. Не подумал как-то, белки не закрепились и вышли вместе со всем. После ИОХ колонка осталась в трис-буфере. Через день промыл колонку фосфатным буфером с pH 5,3, уравновесил им, провёл хроматографию, сделал Лоури. В обоих случаях мутность была во всех фракциях, где что-то выходило, т.е. в первых фракциях до смены буфера и после смены буфера, когда выходили закрепившиеся белки, а вот уже где всё отмылось, там не было мути. Я теперь грешу на трис, потому что в книжке (Справочник биохимика Доусона) написано, что трис в числе прочих соединений мешает определению белка. Но тогда почему мутность только там, где выходило, а где ничего не вышло, там её нет?
(MMM @ 24.04.2016 10:15)
Link to the original post  A осадок образуется только с фосфатным буфером?  попробуйте без белка пустой буфер померить. Есть предположение по поводу фосфата.

Попробую, конечно же.
Муть мутью, но я померил на ФЭКе с ней, вроде получается что-то... Пики есть
https://img-fotki.yandex.ru/get/45082/79581...7_45f43f86_orig
User is offline! MMM
Advanced Member



 old post 24.04.2016 11:02     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Возможно у вас очень высокая концентрация белка и он дает нарастворимый осадок с фосфовольфраматами. А про медно щелочной раствор в Лоури вы случайно не забыли?

This post has been edited by MMM: 24.04.2016 11:16
User is offline! Керуак




 old post 24.04.2016 15:07     Report Post         Personal message  Send an e-mail

В смысле медно-щелочной раствор?
По калибровке получается, что концентрация белка в вышедших после смены буфера фракциях примерно 16,69 мкг/мл

This post has been edited by Керуак: 24.04.2016 15:37
User is offline! MMM
Advanced Member



 old post 24.04.2016 19:34     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Перед Фолиным в методе Лоури белок выдерживается 10 минут в "щелочном" растворе медного купороса и только после этого в этот раствор добавляют Фолина.

This post has been edited by MMM: 24.04.2016 19:36
User is offline! Керуак




 old post 24.04.2016 20:25     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Конечно не забыл
User is offline! MMM
Advanced Member



 old post 24.04.2016 21:37     Report Post         Personal message  Send an e-mail

а каких нибудь твинов, тритонов, нонидетов в буферах не было?
User is offline! Керуак




 old post 24.04.2016 21:56     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Определенно нет
User is offline! Керуак




 old post 25.04.2016 15:11     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Попробовал Лоури сделать чисто с буферами, появилась муть в пробирке с фосфатным... Думаю, нормально ли будет заменить ацетатным? pH вроде подходит
User is offline! MMM
Advanced Member



 old post 25.04.2016 17:30     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Ну, вот, подтверждается первое предположение о том, что фосфат взаимодействует с фосфовольфраматами и фосфомолибдатами изменяет их стехиометрию и они становятся малорастворимыми.

---Думаю, нормально ли будет заменить ацетатным? pH вроде подходит
Я бы предпочел цитрат.

This post has been edited by MMM: 25.04.2016 17:31
User is offline! Oceana777




 old post 30.09.2016 14:21     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Уважаемые коллеги! Помогите разобраться! Занимаюсь определением активности антиоксидантных ферментов. Их активность пересчитывается на мг белка. Белок определяю по Бредфорду. По какой формуле мне производить расчёт белка???
Заранее спасибо
User is offline! MMM
Advanced Member



 old post 30.09.2016 14:29     Report Post         Personal message  Send an e-mail

По градуировочному графику, который строится на основании стандартных растворов белка(чаще всего бычьего сывороточного альбумина).

This post has been edited by MMM: 30.09.2016 14:30
User is offline! Oceana777




 old post 30.09.2016 14:54     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Это сделала! Получила концентрацию белка (скажем 2320) по кривой. Перевела её в мг/мл (2,232). Потом посчитала по формуле = 2.232*3 (объем буфера, в котором растирала растения) / 0,3 (масса навески, г). В итоге получила содержание белка: 22,32 мг/г сырой ткани. Правильно ли это? или нужно ещё умножать на тот объем растит.вытяжки, которую добавляла к Бредфорду?
User is offline! MMM
Advanced Member



 old post 30.09.2016 15:36     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Не делайте копипастов из одного форума в другой. Вы что думаете что среди мол. биологов ясновидящих больше чем среди химиков. Таки я вас уверяю их примерно одинаково нет ни там, ни здесь. Давайте потрудитесь написать, что и как делали.
User is offline! Oceana777




 old post 30.09.2016 15:57     Report Post         Personal message  Send an e-mail

МММ - это Вы к чему? Вы написали: По градуировочному графику, который строится на основании стандартных растворов белка(чаще всего бычьего сывороточного альбумина). Я Вам ответила: Это сделала! И затем расписала ЧТО и КАК делала. Поэтому причём здесь потрудитесь написать что и как делала - не понимаю. Читайте внимательно
User is offline! MMM
Advanced Member



 old post Post on English  30.09.2016 16:13     Report Post         Personal message  Send an e-mail

http://www.chemport.ru/forum/viewtopic.php...=915997#p915997
User is offline! Oceana777




 old post 30.09.2016 16:33     Report Post         Personal message  Send an e-mail

МММ и что? я не имею права задавать одни и те же вопросы на разных форумах?
User is offline! MMM
Advanced Member



 old post 30.09.2016 16:53     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Имеете! Но! В этих своих вопросах вы допускаете одни и те же недочеты никак не улучшая их. Мы бы с радостью вам помогли, но вы сами наступаете на горло собственной песне, тщательно скрывая от нас критически важную информацию, без которой любой ответ не имеет смысла.
User is offline! Oceana777




 old post 03.10.2016 11:51     Report Post         Personal message  Send an e-mail

(MMM @ 30.09.2016 17:53)
Link to the original post  Имеете! Но! В этих своих вопросах вы допускаете одни и те же недочеты никак не улучшая их. Мы бы с радостью вам помогли, но вы сами наступаете на горло собственной песне, тщательно скрывая от нас критически важную информацию, без которой любой ответ не имеет смысла.


МММ, конкретно от Вас я ничего не скрываю, ибо ВЫ никаких вопросов мне ВООБЩЕ не задвали, так что о чём разговор вообще???лично от Вас я ничего не скрываю, ибо именно с Вами у нас диалога не сложилось
User is offline! ksm
Advanced Member



 old post 03.10.2016 21:03     Report Post         Personal message  Send an e-mail  Web site

(Oceana777 @ 30.09.2016 15:54)
Link to the original post  Это сделала! Получила концентрацию белка (скажем 2320) по кривой. Перевела её в мг/мл (2,232). Потом посчитала по формуле = 2.232*3 (объем буфера, в котором растирала растения) / 0,3 (масса навески, г). В итоге получила содержание белка: 22,32 мг/г сырой ткани. Правильно ли это? или нужно ещё умножать на тот объем растит.вытяжки, которую добавляла к Бредфорду?

огласите, пожалуйста, оптическую плотность при этом (при 2320), и длину волны и что у Вас за прибор?

This post has been edited by ksm: 04.10.2016 04:28
User is offline! Oceana777




 old post 04.10.2016 16:18     Report Post         Personal message  Send an e-mail

(ksm @ 03.10.2016 22:03)
Link to the original post  огласите, пожалуйста, оптическую плотность при этом (при 2320), и длину волны и что у Вас за прибор?



Оптическая плотность: примерно 1,0513
Длина волны: 595 нм
Прибор: СФ 2000, Россия
User is offline! ksm
Advanced Member



 old post 05.10.2016 01:58     Report Post         Personal message  Send an e-mail  Web site

ну вы учтите, что в районе единицы по ОП градуировка уже нелинейно себя вести может. если у вас кривая до 2 ОП, то пожалуйста
(вообще ржачно: "примерно 1.0513")

This post has been edited by ksm: 05.10.2016 02:08
User is offline! Oceana777




 old post 10.10.2016 15:36     Report Post         Personal message  Send an e-mail

(ksm @ 05.10.2016 02:58)
Link to the original post  ну вы учтите, что в районе единицы по ОП градуировка уже нелинейно себя вести может. если у вас кривая до 2 ОП, то пожалуйста
(вообще ржачно: "примерно 1.0513")


ksm, не понимаю что здесь РЖАЧНОГО? у меня большой объём экспериментального материала и я назвала Вам первую плотность, которую в тетради посмотрела. Плотность всё же меняется и в зависимости от объекта и в зависимости от воздействия,и даже в зависимости от продолжитеьности воздействия. так что ничего ржачного и нет.
User is offline! Esya
Advanced Member
PA, USA



 old post 10.10.2016 16:03     Report Post         Personal message  Send an e-mail  Web site  ICQ

(Oceana777 @ 10.10.2016 07:36)
Link to the original post  ksm, не понимаю что здесь РЖАЧНОГО? у меня большой объём экспериментального материала и я назвала Вам первую плотность, которую в тетради посмотрела. Плотность всё же меняется и в зависимости от объекта и в зависимости от воздействия,и даже в зависимости от продолжитеьности воздействия. так что ничего ржачного и нет.


просто наше поколение еще на уроках физики учили округлять показания хотя бы до точности прибора... не указывать и не доволить рН до пятого знака, скажем

потому и ржачно, что вы даже в тетрадку занесли охрененное количество незначащих цифр

Number of thanks: 1These members thanked the author (1): ksm
User is offline! MMM
Advanced Member



 old post 10.10.2016 16:45     Report Post         Personal message  Send an e-mail

(ksm @ 05.10.2016 02:58)
Link to the original post  ну вы учтите, что в районе единицы по ОП градуировка уже нелинейно себя вести может. если у вас кривая до 2 ОП, то пожалуйста
(вообще ржачно: "примерно 1.0513")

Кстати, для обычного нормально работающего брэдфорда нелинейность начинается в районе 0,5-0,7 единицы D. Но опять же, кстати, СФ 2000 умеет строить криволинейные градуировки на основе линейных многочленов. Что касается точности измерений, ну, Брэдфорд вообще не подразумевает точность выше 10%. А допускает ошибки и в 50%. Например, при градуировке по бычьему альбумину, если измерять антитела, то ошибка больше чем в 2 раза.

This post has been edited by MMM: 10.10.2016 16:46

Number of thanks: 1These members thanked the author (1): ksm
User is offline! ksm
Advanced Member



 old post 11.10.2016 16:57     Report Post         Personal message  Send an e-mail  Web site

(Oceana777 @ 10.10.2016 16:36)
Link to the original post  ksm, не понимаю что здесь РЖАЧНОГО? у меня большой объём экспериментального материала и я назвала Вам первую плотность, которую в тетради посмотрела. Плотность всё же меняется и в зависимости от объекта и в зависимости от воздействия,и даже в зависимости от продолжитеьности воздействия. так что ничего ржачного и нет.

ну не КРИЧИТЕ так на меня!!!111111111
User is offline! ksm
Advanced Member



 old post 11.10.2016 17:31     Report Post         Personal message  Send an e-mail  Web site

Уважаемая Oceana777, как писал вам МММ вам при ваших опттических плотностях необходима криволинейная градуировка по БСА с привлечением линейных многочленов. если вы используете просто линейный коэффициент в пересчете, то, боюсь, весь ваш большой объём экспериментального материала следует переизмерить, чтобы удовлетворить требованию к линейности (т.е. 0,5-0,7 по шкале ОП). это достигается серией разбавлений. а весь ваш колоссальный труд по измерению ОП в районе единицы для большого объема экспериментального материала необходимо просто познакомить с обыкновенным педальным ведром.
User is offline! fargo

Томск, Россия



 old post 10.11.2016 15:37     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Если в среде содержатся полифенолы, возможно ли их учесть при определении белка по Лоури? Например, если рассчитать OD для фенолов в той же пробе используя карбонат и реактив Фолина, затем определить содержания белка в этой же пробе, используя добавочно медь. В итоге, полученная разность в показаниях OD должна соответствовать белку. Или так нельзя делать. smile.gif
User is offline! MMM
Advanced Member



 old post 10.11.2016 16:12     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Да, делать-то мозьно, вот только если реакция на меди будет составлять доли процента реакции на Фолине без меди, то вас это не спасет. Т.е. такое возможно на хорощем приборе и при условии, что соотношение сигналов не превышает 1:1 , а лучще 5-30% от сигнала белка.
User is offline! metrim
Advanced Member
Москва



 old post 14.01.2017 14:42     Report Post         Photo  Personal message  Send an e-mail

А продажные реактивы для Брэдфорд (Термо или Био-рад) - это та же самая рецептура, что приведена здесь? или туда добавляется что то для стабильности и повышения сроков хранения?
User is offline! MMM
Advanced Member



 old post 14.01.2017 16:53     Report Post         Personal message  Send an e-mail

metrim! Это не вопрос для ответа. Как вообще подобные вопросы приходит в голову задавать на форуме студентов и научных сотрудников.
User is offline! metrim
Advanced Member
Москва



 old post 14.01.2017 23:33     Report Post         Photo  Personal message  Send an e-mail

Что то не догоняю: в чем проблема вопроса или форума ....
Имеется ввиду что "сиречь есть страшная коммерческая тайна" ?
User is offline! MMM
Advanced Member



 old post 15.01.2017 20:25     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Да, даже если и тайна или не тайна, откуда научные сотрудники должны знать, что происходит на каком-то заводе.
User is offline! Елизавета12345




 old post 09.03.2021 14:30     Report Post         Personal message  Send an e-mail

Коллеги, подскажите почему может быть расхождение в концентрации белка при 280нм и при 595 ни (Бредфорд)?
guest: София
IP-stamp: frXzihUMrvb8M
guest



 old post 21.05.2021 13:39     Report Post       

Здравствуйте! Готовлю реактив Бредфорда. Использую краситесь кумасси G250. При смешивании красителя со спиртом получается синий раствор. При добавлениии в полученный раствор ортофосфорной кислоты 85%( по каплям), раствор приобретал коричнево-вишневый цвет. После добавляла бидистиллят , раствор стал синим. При фильтовании через « синюю» ленту , раствор стал бледно голубо- фиолетовый. Ответ не белок не даёт. Я попробовала добавить кислоты больше, чем надо, получился раствор черно коричневый. При добавлении белка реагирует. Вопрос: зачем нужно доводить водой до метки ? Почему нельзя просто использовать спирт, кумасси и кислоту?

*





Name:

 Enable Smilies · Show Smilies Pop Up Window
Icons designation:

   Say THANKS to the author — say THANKS to the author
   Delete Post — delete
   Edit Post — edit
   Put in the news column — put in the news column
   Quote Post — quote the post
   multiquote  not included/multiquote included — quote several posts
   Report SPAM — mark spam message
   Report Post — report post to the moderator
   User is online!/User is offline! — author online/offline
   Photo — photo of the author

   - other designations -
 
   *
« Next Oldest · Molecular and cellular biology · Next Newest »
pages (4): < 1 2 3 4 >
Fast ReplyReply to this topicStart new topic

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Helicon · Dia-m · InterLabService · Beckman Coulter · SkyGen · OPTEC · BIOCAD · Evrogen · Syntol · Bioline · Sartorius · Khimexpert · SibEnzyme · Tecan · Danies · NPP «TRIS» · Bialexa · FizLabPribor · Genotek · ATG Service Gene · Biogen-Analitika
Your forum  ·  editor@zbio.net  ·  Time is now: 28.03.24 12:31
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft