Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
error Постоянный участник 192.168.0.1 |
Прогнал несколько плашек - теперь думаю, как интерпретировать полученные кривые плавления. Софт группирует образцы автоматически. В софте оном есть чудесная штука - Sensitivity - ее крутишь, количество и состав обнаруженных групп, понятно, меняется. На мой непосвященный взгляд, сие напоминает доводку рН буфера посредством верчения ручки "КРУТИЗНА" на рН-метре. Изначально идея была выбрать из каждой группы по паре образцов и секвенировать. Типа, затраты на сиквенс слегка оптимизировать в свете глобального финансового кризиса - 96 пар праймеров х 60 индивидуумов все же не сову об пень. Но как-то очень субъективно процесс выглядит... На приведенной картинке оно видит три группы, плюс зеленые кривые - образцы, которые софт затруднился отнести к какой-либо группе. Да, размер фрагментов 250-400 bp, химия GoTaq Hot Start + LC Green. Any ideas, opinions? Картинки: Plate8_2.jpg — (78.41к) 31.10.2008 — 14.11.2008 |
D evgenii Постоянный участник Томск |
Использую профили сравнения: положительный (мутации); норма (без мутации); исследуемый образец. От этого и пляшу...
|
error Постоянный участник 192.168.0.1 |
|
D evgenii Постоянный участник Томск |
Пока в голову приходит только выход, указанный вами. Для достоверности погонять несколько раз одни и те же пробы, удостоверится, что действительно различия присутствуют. А что кстати за образец? |
error Постоянный участник 192.168.0.1 |
|
D evgenii Постоянный участник Томск |
- хорошая песенка Если что-нить надумаю еще... напишу |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
...губит людей не пиво, губит людей вода. |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
мы б не узнали алкоголя; а, значит, пьянство не порок, а высшей благости урок. Г |
error Постоянный участник 192.168.0.1 |
|
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
|
error Постоянный участник 192.168.0.1 |
(Yuri K @ 31.10.2008 10:04) I am lost here. Since all melting curves are of the same shape, only shifted along the T axis, the difference curves must also be of the same shape. Nevertheless, some show bell curves with a maximum and some show bell curves with a minimum, and some curves are S-shaped. Why would this be the case? Насколько я понял, софт считает отклонение от средней интенсивности флуоресценции в каждой точке кривой, поэтому график и называется Normalized difference curves. Для тех же кривых плавления можно построить первую производную, как обычно: Картинки: Plate8_2a.jpg — (49.06к) 31.10.2008 — 14.11.2008 |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(error @ 31.10.2008 16:35) Насколько я понял, софт считает отклонение от средней интенсивности флуоресценции в каждой точке кривой, поэтому график и называется Normalized difference curves. Для тех же кривых плавления можно построить первую производную, как обычно: Right, but I still don't get it. What is "средней интенсивности флуоресценции ?" |
error Постоянный участник 192.168.0.1 |
|
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
|
Guest IP-штамп: frnwErsgt6v.2 гость |
1. На что нормализуете? 2. Как меняется состав и количество групп при увеличении/уменьшении "sensitivity"? 3. Поскольку LightScanner плашечный, в отличие от LightCycler 1.0-2.0, RG и HR-1, то надо еще исключить неравномерность прогрева/охлаждения. Не пробовали гонять один и тот же образец в разных лунках? |
Guest IP-штамп: frnwErsgt6v.2 гость |
|
error Постоянный участник 192.168.0.1 |
(Guest @ 04.11.2008 17:21) Три уточняющих (возможно, наивных) вопроса: 1. На что нормализуете? 2. Как меняется состав и количество групп при увеличении/уменьшении "sensitivity"? 3. Поскольку LightScanner плашечный, в отличие от LightCycler 1.0-2.0, RG и HR-1, то надо еще исключить неравномерность прогрева/охлаждения. Не пробовали гонять один и тот же образец в разных лунках? Хм, я ХРМ вообще первый раз гоняю 1. Насколько понял, нормализация производится по флуоресценции самого образца при двух температурах: до и после плавления. Это позволяет отсечь неспецифику, если таковая присутствует (плавится при более низкой температуре). 2. При уменьшении чувствительности количество групп снижается, разбиение по группам меняется соответственно - софт разбрасывает те же образцы на меньшее число групп. Чем больше чувствительность, тем неувереннее становится calling - групп больше, и больше образцов, которые софт затрудняется отнести к какой-либо группе. 3. Нагрев/охлаждение в LightScanner осуществляются потоком воздуха, захват картинки CCD-камерой, как я понял. Неравномерность температуры при такой конструкции минимальна по сравнению с Пельтье-блоком. Критично - плашки черные, лунки белые. В разных лунках гонять несколько повторностей была мысль, но для моих целей наличие false positives не критично, так что не стал. (Guest @ 04.11.2008 17:23) Нет - это первичный скрининг. Только вскрытие (сиквенс) покажет Хозяева прибора, впрочем, генотипирование на нем гоняют. Пока что работает. |
Guest IP-штамп: frE5ApBDd2PUQ гость |
2. Я бы поступил вот как: выкрутил бы sensitivity на максимум, зафиксировал бы результаты, затем выкрутил бы ее на разумный минимум, также зафиксировал бы результаты, образцы, одинаково расклассифицированные в обоих случаях как принадлежащие к разным подгруппам, просеквенировал бы (2-4 образца на один снип), если результаты сиквенса совпадут с ожидаемыми, то поставил бы мелтинг всех остальных образцов с опорой на эти как на контрольные. Думаю, так Вы усилия на сиквенс потратите минимальные и из мелтинга извлечете максимум пользы. 3. Воздух-то воздухом, а неравномерность все равно имеется, про это у Виттвера две статьи есть, одна 2003, другая 2006, кажется, года.
|
error Постоянный участник 192.168.0.1 |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(error @ 07.11.2008 02:46) Похоже у тебя сиквенсы пишком ходют Нормально - вечером отправил -утром получил Чего ты к Лайтсканнеру привязался если три манускрипта |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(error @ 05.11.2008 00:23) Хм, я ХРМ вообще первый раз гоняю 1. Насколько понял, нормализация производится по флуоресценции самого образца при двух температурах: до и после плавления. Это позволяет отсечь неспецифику, если таковая присутствует (плавится при более низкой температуре). 2. При уменьшении чувствительности количество групп снижается, разбиение по группам меняется соответственно - софт разбрасывает те же образцы на меньшее число групп. Чем больше чувствительность, тем неувереннее становится цаллинг - групп больше, и больше образцов, которые софт затрудняется отнести к какой-либо группе. 3. Нагрев/охлаждение в ЛигхтСцаннер осуществляются потоком воздуха, захват картинки ЦЦД-камерой, как я понял. Неравномерность температуры при такой конструкции минимальна по сравнению с Пельтье-блоком. Критично - плашки черные, лунки белые. В разных лунках гонять несколько повторностей была мысль, но для моих целей наличие фалсе поситивес не критично, так что не стал. Нет - это первичный скрининг. Только вскрытие (сиквенс) покажет Хозяева прибора, впрочем, генотипирование на нем гоняют. Пока что работает. А как же ХРМ на ЛайтЦиклер 480 который Пелтье ? У Роша концы с концами того |
error Постоянный участник 192.168.0.1 |
(Guest @ 07.11.2008 05:25) Дык, если лайтсканнер с айплексом отработают как надо - четвертый в Природу
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |