Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* беzлигазное лигирование -- поделитесь опытом. --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.07.2019 03:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

беzлигазное лигирование

поделитесь опытом.

Понравилась мене эта идейка про лигирование просто путем котрансформациии двух фрагментоб ДНК.. Главное чтоб у них на концах гомологичное перекрытие было 20 нуклеотидов, и все дела ...

Эффективность низкая , но работает. Нужные клоны со вставкой находятся таки, один на 10.

Проблема в стабильности ... два раза получилось, а на третий ну никак не хочет. Компетентность в контроле с [pUC19] зашкаливает , под 10 в 9ой степени. Это химические клетки, TOP10, не електропорация, все делаю имено так как и пишут в публикациях на эту тему.

вектор 5 кб со вставкой ... естесвенно что все ПЦР -продукты. вставка 1кб , соотношение беру 1 к 5. Ампициллин ...

Вообще ничего не растет на чашах , даже случайных колоний нет . То есть все очень хорошо , но где-то вот собая зарыта ...

Какие будут соображения про эту собаку?

В предыдущие разы получалось с гораздо более длинным вектором в 8 кб и вставка в 1кб. Но тоже было конечно на пределе возможного все... В одном случае нашел 3 клона позитивных из 20 которые выросли , а в другом вообще один клон из 16.

А сейчас вот даже негативных клонов нет .
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.07.2019 12:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

А чем вам лигаза не глянулась? Дефицит?

Сообщение было отредактировано R-J-Dio - 03.07.2019 12:47
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.07.2019 13:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Да лигазы-то тонны , кто-то понакупил зачем-то , так и лежит уже годами., Но нужно срочно заменить фрагмент ДНК на другой , а сайтов рестрикции нету, да и ферментов с десяток , просроченных лет на 5 но все еще дышашаих , хоть и на ладан. ну и вообще , покупать ресктриктазы на одно лигирование у нас денег нет. Шеф прижимистый. А у меня нет своего финансирования. Вот приходится творчески к делу подходить.

Да и мне нравится этот современный метод , действительно же все киты обещают простоту и надежность и небывалую экономию всего и вся. Очень удобно .

Любое клонирование за нефиг делать , только праймеры заказал с перехлестом и ПЦР прогнал, из геля нужыные полоски вырежал , почистил, , смешал фрагменты и трансформировал .. А дальше Е-коли сама все сделает. Мечта-технология.

Но в ней явно есть какие-то подводные камни. не все этак просто.

Вот сегодня попробую в 10 раз больше ДНК взять в трансформацию и может еще что надо? Может имеет смысл отжечь эту смесь и один раунд с ДНК полимеразой прогнать? , Хотя раньше я делал и и получалось именно по простому , без этого дополонительного раунда , хотя я понится таки инкубировал смесь фрагментобв 15 минут на 56градусов перед добавлением к клетям на льду.

Интересно бы послушать что у другий людей с этим методом получается.. А то же одна реклама кругом ..
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 03.07.2019 13:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

В китах они используют особый штамм бактериальный с рекомбиназной активностью , которая в [Top10] удалена ... Но есть публикация , кстати какой-то российский аспирант из Института Вентера Крейга, где весьма чтко показано что в ТОП10 осталась какая-то еще активность которая и обеспечивает успех такого клонирования, что собственно я и попдтвердил уже 2 раза .. Но вот на третий раз что-то застряло все, причем капитально так, вообще клонов нет, даже без рекомбинации которые.
Может природа этих концов ДНК какую-то роль в этом играет.. ну скажем что некоторые последовательности или быстро деградируют или не рекомбинируют?

Кстати тоже идея ... может вода старая и грязная уже и там нуклазы в ней развелись.. А то у нас сплесенями таботают вокруг ... споры эти везде. постоянно заросты идут непойми откуда.

Сообщение было отредактировано Asterix - 03.07.2019 13:47
Участник оффлайн! LMP
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.07.2019 09:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

А вы к своему будущему соавтору по , Nature к обратитесь он такие вещи вон... публикует. В одну пробирку ПЦР продукт а в другую плазмиду. Он вам наводит луч и получите: трансгрессия со встройкой. У него правда дальше 20 км не бьёт, но так тож дела 10 летней давности, а сейчас может и апгрейд. Ничего, надёжный метод, вы ж понимаете в Бэбим пургу не принимают))))начните с малого, это проще чем сиомы поменять umnik.gif

Сообщение было отредактировано LMP - 04.07.2019 09:57
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.07.2019 10:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Про Сиомы - это в беседу, у нас с Петровичем там длинное обсуждение идет его идей про сакральные аспекты ДНК кода и их развития . ..

Тут у меня практический и весьма животрепещущий вопрос , причем интересный не только мне , я так думаю.

Мне нравится эта технология клонирования ДНК... когда не надо ни рестриктаз ни лигазы ... Это же мечта молбиолога.
Но вот как заставить это все стабильно работать? каждый раз - как сюрприз ..

Киты кстати недешевые фирмы продают , Та же [ТаKаRа] например , тут на молбиоле была реклама их презентации этой технологии в Москве ... но это коммерческая реклама ... а я вот реально начал с этим работать и обнаружил проблемы

Хотелось бы чтоб другие специалисты поделились своими соображениями, в чем там собака зарыта , или -О чем молчит [ТаKaRа].-

Можно даже теоретические соображения или опыт из смежной области сюда же дать
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 04.07.2019 20:24     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Ну что ж господа молбиологи . похоже заработало .. Но на грани возможного конечно..

Вот ведь, бля, какой простой протокол, а как сложен в реализации... там оказываетсya столько нюансов , о которых не пишут в газетах...
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 07.07.2019 18:48     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

То есть шаг вправо-влево -расстрел? То есть если субоптимально что-то замешал или клетки подсели-досвидос? Поэтому я этой хренью не заморачиваюсь. Технологии должны быть такими, чтобы работали ВСЕГДА и допускали люфт, иначе времени будет уходить туча. Не могу себе такого позволить. время-главный ресурс. а что сайтов нет или ещё что-ну, безвызодных положений не бывает

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): dk
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.07.2019 01:54     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

У нас ферментов нет ... приходится вот клонировать ДНК инновационно.. Как только будет бюджет я закуплю все что надо для нормальной работы..

Но похоже я таки подсел на эту новую технологию.. Это на грани возможного , но получается же , черт ее подери.

У меня из 16 клонов один позитив с нужной мне рекомбинацией ... Но это вполне реально же ... это не сказка , оно действительно работает. И это универсальная технология не требующая рестриктаз и лигаз...
Участник оффлайн! dk
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 10.07.2019 07:58     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Погодите, вы сами выше писали "Да лигазы-то тонны" - а теперь уже "У нас ферментов нет". В чём проблема для той же вставки заказать не "праймеры с перехлестом" - а с нормальным сайтом рестрикции для нормальной плазмиды? Вы же сами говорите, что у вас есть рестриктазы (ну и что, что 5-летние, в морозильники они прекрасно живут). При этом вы согласны тратить время и геморроиться с лажовым протоколом для эффективности лигирования 1/16 (эффективность которого вы ещё не проверяли) - но вам нет возможности купить за 1,5 тыщи Сибэнзимоский фермент? А дальше что - кипячение жёлтых "носиков", ПЦР в пробирках с 3 термостатами и секвенирование "на геле"? Нет, я такого понять не могу, это уже за гранью зла и добра. Уходите от такого "прижимистого шефа" нафиг - вы со своим творческим подходом и энтузиазмом найдёте нормальную работу по душе.
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.07.2019 15:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Ну я играю с наукой , именно мне по душе подобные игры в науку, прикольный протокол мне нравится идея .. надо просто набрать опыта и понять какие мелкие детали оказывают влияние на еффективность процесса. Уже появились идеи где собаку рыть.

Ну и правда рекстриктазы мы в Промеге покупаем , у нас коллективный договор с ней. Но у нас они и никому кроме меня не нужны.. У народа даже ПЦР простейшая не получаэтся и гели заливают на воде и форез не идет, составить попорцию и пересчитать состав буфера - это уже запредельная математика ... ну вот такие у нас аспиранты с Ближнего Востока, причем некоторые у себя там по 7 лет учились , дипломы получили ,а в лаборатории никогда не работали... миллиграммы от граммов не отличают. Жуть.. Право можно просто диплом купить и с таким же успехом заниматься научной работой.

Шеф уже тоже морщится ... он не думал что там такая печальная ситуация когда их брал. Ну стипендии-то им как-то дали .. собственно казалось что вот дешевая молодая рабочая сила ... но не тут то было.

Вообщем дело не в рестриктазах, а новом методе клонирования ... хотя какой же он новый, это он для меня новый. Собственно это уже 3 раз у меня так клонируется , один раз отлично было , под 50% клонов с вставкой , второй раз вот очень сложно , один на 24 нашелся , а вот сейчас 1 на 16. Вообщем меня устраивает 1 к 10... ПЦР на колониях сделать несложно. 16 колоний очень даже удобно , как раз на мини-гель.

Вообще-то надо просто купить другой штамм бактерий , который в ките продается именно для такого клонирования. С интактным [RecA] Но у меня вот все этак ... творческий подход.

Оборудование в лабе сам отремонтировал .. Тоже жуть , годами пользовались неисправным электропоратором и думали что все так и должно быть. .. а он прекрасно работает , просто надо было отключить излишнюю систему защиты от дурака , и все стало получаться нормально, как в протоколе.
Его в студенцэском практикуме пользуют тоже и в результате частых замыканий и микровзрывов в кювете там электроды в держателе для кювет перестали хорошо контактировать ..
Вот собственно и вся проблема , которая обьясняла совершенно дикое поведение прибора. Типа он показывал вольтаж выше чем он может дать в принципе. Иногда он зависал и выдавал сообщение - типа сам не знаю что со мной , но чувствую нехорошо что-то.
Ну и если контакта совсем не было то выдавал идеальные параметры пульса , как будто никакой кюветы там и не было. . теперь как часики пашет.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.07.2019 18:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

к терапевту. Кухонные подергивания. Не интересно
Участник оффлайн! dk
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 10.07.2019 20:59     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Не, ну если человеку нравится - почему бы и нет. Всё не водку жрать а потом на форуме "срать в комменты". Обычно, увлечение подобным "рукоделием" с возрастом проходит. Единственное, не было бы потом "мучительно больно за бесцельно прожитые годы". Но тут, опять же "каждый выбирает по себе". Лично вот мне, честно, было бы жаль времени возится с подобным "безлигазным лигированием". А вот починить поратор - одобряю! Сам люблю такое: руки приложишь - так и душа радуется: "ласку и смазку" всё любит!
Участник оффлайн! Asterix
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.07.2019 21:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Годы уже бесцельно прожиты и даже ассистант позишион мне не грозит никак , так что осталось только развлекаться и просто заниматься наукой ... без вот этих патентов и прочей ***ни. как они меня достали с этими патентами ... ну зачем , ну сделаю новую технологию

- пусть все пользуются бесплатно , ну зачем не эти миллионы на старости лет? меня моя гос-пенсия устраивает, хотя хотелось бы ее удвоить и еще лучше утроить ... так будет вообще зашибись как хорошо.. но у нас социализм и пенсию удвоить нереально ... Так нельзя какой бы ты не был умный ученый ... это нельзя. рабочие будут обижены ... нехорошо.

От каждого - по-способностям , каждому по минимальным, гос-потребностям. .. Ну если ты не из класса землевладельцев ... там другой расклад , но они в науку особо не рвутся. Им оно не надо.. у них и так все есть.
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  10.11.2021 19:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

https://wanelo.co/replicarolexwatches
https://musescore.com/fakerolexwatches
https://www.racked.com/users/Replicarolexwatches
https://sketchfab.com/Rolexrelicawatches
http://www.video-bookmark.com/bookmark/433...eplica-watches/
https://www.slideserve.com/ReplicawatchesUK...pt-presentation
https://www.theverge.com/users/Replicarolexwatches
https://www.yumpu.com/en/document/read/6532...lica-watches-uk
https://online.flippingbook.com/view/152275247/
https://www.instapaper.com/p/8767342
https://www.bigblueview.com/users/Replicarolexwatches
https://weheartit.com/watcheshutuk
https://sites.google.com/view/replicarolexwatches24/home
https://www.indiehackers.com/post/hints-on-...atch-113aef73a9
http://replicawatchesuk.esportsify.com/for...ica-rolex-watch
Участник оффлайн! watchesonline89
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  25.12.2022 10:35     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

https://ameblo.jp/omegawatches89/entry-12756646005.html
https://omegawatches89.bigcartel.com/produc...s-replica-rolex
https://penzu.com/p/d8b4c076
https://omegawatches89.gumroad.com/p/reason...-are-so-popular
https://omegawatches89.gumroad.com/p/tips-f...replica-watches
https://omegawatches89-95.webselfsite.net/a-propos
https://anotepad.com/notes/2w2d9wgq
https://www.myminifactory.com/stories/reaso...s-6331ca21647d6
https://omegawatches89.seesaa.net/article/490300837.html
https://blog.udn.com/omegawatches89/176226733
https://62e8da780bf7c.site123.me/blog/where...-watches-online
https://wakelet.com/wake/NSGeOdLxkniZ60lTSrkpM
https://telegra.ph/Replica-Watches-Find-Hig...ms-Online-08-03
https://omegawatches89.simplesite.com/452939025

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 20:34
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft