Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Asterix Постоянный участник |
поделитесь опытом. Понравилась мене эта идейка про лигирование просто путем котрансформациии двух фрагментоб ДНК.. Главное чтоб у них на концах гомологичное перекрытие было 20 нуклеотидов, и все дела ... Эффективность низкая , но работает. Нужные клоны со вставкой находятся таки, один на 10. Проблема в стабильности ... два раза получилось, а на третий ну никак не хочет. Компетентность в контроле с [pUC19] зашкаливает , под 10 в 9ой степени. Это химические клетки, TOP10, не електропорация, все делаю имено так как и пишут в публикациях на эту тему. вектор 5 кб со вставкой ... естесвенно что все ПЦР -продукты. вставка 1кб , соотношение беру 1 к 5. Ампициллин ... Вообще ничего не растет на чашах , даже случайных колоний нет . То есть все очень хорошо , но где-то вот собая зарыта ... Какие будут соображения про эту собаку? В предыдущие разы получалось с гораздо более длинным вектором в 8 кб и вставка в 1кб. Но тоже было конечно на пределе возможного все... В одном случае нашел 3 клона позитивных из 20 которые выросли , а в другом вообще один клон из 16. А сейчас вот даже негативных клонов нет . |
R-J-Dio Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано R-J-Dio - 03.07.2019 12:47 |
Asterix Постоянный участник |
Да и мне нравится этот современный метод , действительно же все киты обещают простоту и надежность и небывалую экономию всего и вся. Очень удобно . Любое клонирование за нефиг делать , только праймеры заказал с перехлестом и ПЦР прогнал, из геля нужыные полоски вырежал , почистил, , смешал фрагменты и трансформировал .. А дальше Е-коли сама все сделает. Мечта-технология. Но в ней явно есть какие-то подводные камни. не все этак просто. Вот сегодня попробую в 10 раз больше ДНК взять в трансформацию и может еще что надо? Может имеет смысл отжечь эту смесь и один раунд с ДНК полимеразой прогнать? , Хотя раньше я делал и и получалось именно по простому , без этого дополонительного раунда , хотя я понится таки инкубировал смесь фрагментобв 15 минут на 56градусов перед добавлением к клетям на льду. Интересно бы послушать что у другий людей с этим методом получается.. А то же одна реклама кругом .. |
Asterix Постоянный участник |
Может природа этих концов ДНК какую-то роль в этом играет.. ну скажем что некоторые последовательности или быстро деградируют или не рекомбинируют? Кстати тоже идея ... может вода старая и грязная уже и там нуклазы в ней развелись.. А то у нас сплесенями таботают вокруг ... споры эти везде. постоянно заросты идут непойми откуда. Сообщение было отредактировано Asterix - 03.07.2019 13:47 |
LMP Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано LMP - 04.07.2019 09:57 |
Asterix Постоянный участник |
Тут у меня практический и весьма животрепещущий вопрос , причем интересный не только мне , я так думаю. Мне нравится эта технология клонирования ДНК... когда не надо ни рестриктаз ни лигазы ... Это же мечта молбиолога. Но вот как заставить это все стабильно работать? каждый раз - как сюрприз .. Киты кстати недешевые фирмы продают , Та же [ТаKаRа] например , тут на молбиоле была реклама их презентации этой технологии в Москве ... но это коммерческая реклама ... а я вот реально начал с этим работать и обнаружил проблемы Хотелось бы чтоб другие специалисты поделились своими соображениями, в чем там собака зарыта , или -О чем молчит [ТаKaRа].- Можно даже теоретические соображения или опыт из смежной области сюда же дать |
Asterix Постоянный участник |
Вот ведь, бля, какой простой протокол, а как сложен в реализации... там оказываетсya столько нюансов , о которых не пишут в газетах... |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
Asterix Постоянный участник |
Но похоже я таки подсел на эту новую технологию.. Это на грани возможного , но получается же , черт ее подери. У меня из 16 клонов один позитив с нужной мне рекомбинацией ... Но это вполне реально же ... это не сказка , оно действительно работает. И это универсальная технология не требующая рестриктаз и лигаз... |
dk Постоянный участник Россия |
|
Asterix Постоянный участник |
Ну и правда рекстриктазы мы в Промеге покупаем , у нас коллективный договор с ней. Но у нас они и никому кроме меня не нужны.. У народа даже ПЦР простейшая не получаэтся и гели заливают на воде и форез не идет, составить попорцию и пересчитать состав буфера - это уже запредельная математика ... ну вот такие у нас аспиранты с Ближнего Востока, причем некоторые у себя там по 7 лет учились , дипломы получили ,а в лаборатории никогда не работали... миллиграммы от граммов не отличают. Жуть.. Право можно просто диплом купить и с таким же успехом заниматься научной работой. Шеф уже тоже морщится ... он не думал что там такая печальная ситуация когда их брал. Ну стипендии-то им как-то дали .. собственно казалось что вот дешевая молодая рабочая сила ... но не тут то было. Вообщем дело не в рестриктазах, а новом методе клонирования ... хотя какой же он новый, это он для меня новый. Собственно это уже 3 раз у меня так клонируется , один раз отлично было , под 50% клонов с вставкой , второй раз вот очень сложно , один на 24 нашелся , а вот сейчас 1 на 16. Вообщем меня устраивает 1 к 10... ПЦР на колониях сделать несложно. 16 колоний очень даже удобно , как раз на мини-гель. Вообще-то надо просто купить другой штамм бактерий , который в ките продается именно для такого клонирования. С интактным [RecA] Но у меня вот все этак ... творческий подход. Оборудование в лабе сам отремонтировал .. Тоже жуть , годами пользовались неисправным электропоратором и думали что все так и должно быть. .. а он прекрасно работает , просто надо было отключить излишнюю систему защиты от дурака , и все стало получаться нормально, как в протоколе. Его в студенцэском практикуме пользуют тоже и в результате частых замыканий и микровзрывов в кювете там электроды в держателе для кювет перестали хорошо контактировать .. Вот собственно и вся проблема , которая обьясняла совершенно дикое поведение прибора. Типа он показывал вольтаж выше чем он может дать в принципе. Иногда он зависал и выдавал сообщение - типа сам не знаю что со мной , но чувствую нехорошо что-то. Ну и если контакта совсем не было то выдавал идеальные параметры пульса , как будто никакой кюветы там и не было. . теперь как часики пашет. |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
dk Постоянный участник Россия |
|
Asterix Постоянный участник |
- пусть все пользуются бесплатно , ну зачем не эти миллионы на старости лет? меня моя гос-пенсия устраивает, хотя хотелось бы ее удвоить и еще лучше утроить ... так будет вообще зашибись как хорошо.. но у нас социализм и пенсию удвоить нереально ... Так нельзя какой бы ты не был умный ученый ... это нельзя. рабочие будут обижены ... нехорошо. От каждого - по-способностям , каждому по минимальным, гос-потребностям. .. Ну если ты не из класса землевладельцев ... там другой расклад , но они в науку особо не рвутся. Им оно не надо.. у них и так все есть. |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |