Тест на коронавирус 3777 долларов
https://www.youtube.com/watch?v=IlmoIUtPoiY
4:20
А они не ОФИГЕЛИ?

Нормально будет, когда мне дадут права куратора темы. Только тотальные зачистки и растрелы могут помочь.

Друзья-китайцы опубликовались в Клетке
Ждем теперь человекообразных обезьян. Предвтавляю , какой поднимут вой религиозные фундаменталисты и прочие креоцианисты.


Cell 172, 1–7, February 8, 2018

Resource
Cloning of Macaque Monkeys
by Somatic Cell Nuclear Transfer
Zhen Liu,1 Yijun Cai,1 Yan Wang,1 Yanhong Nie,1 Chenchen Zhang,1 Yuting Xu,1 Xiaotong Zhang,1 Yong Lu,1
Zhanyang Wang,1 Muming Poo,1 and Qiang Sun1,2,* 1Institute of Neuroscience, CAS Center for Excellence in Brain Science and Intelligence Technology, State Key Laboratory of Neuroscience,
CAS Key Laboratory of Primate Neurobiology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China
2Lead Contact
*Correspondence: qsun@ion.ac.cn
https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.01.020

В чем проблема? У меня давно это было.

1. Выглядит как типичный апоптоз
2. Что бы разобраться нужны контроли.
3. Взять другую плазмиду и лучше другой протокол выделения
4. Пару альтернативных протоколов трансфекции. кальцый-фосфат очень травматичный для многих типов клеток. Фюджен или Амакса на порядки лучше (но естественно не дешевле)
5. Вирусы тоже хороши. Например ленти.

PS 1' Поставить тест на апоптоз
If it looks like a duck, swims like a duck and quacks like a duck, then it probably is a duck.

Годная книжка и не очень заумно написана
Wing-Kin Sung
ALGORITHMS FOR
NEXT-GENERATION SEQUENCING
(Chapman & Hall/CRC Mathematical and Computational Biology)

CRC Press | 2017 | ISBN: 978-1-4665-6550-0 | 362 pages | PDF (rar) | 20.9 Mb

http://forum.ru-board.com/topic.cgi?forum=...6&start=1420#lt

https://www.upload.ee/files/7034410/Algorit...encing.rar.html

Всем привет.
Если быть строгим то у меня вопрос не совсем по теме. Просто не хочу плодить лишнюю ветку по NGS.
Я пытаюсь разобраться как работает псевдоэлайнер Каллисто. И у меня возникает много вопросов по алгоритму его работы. Как я понимаю, все начинается с постройки "индекса" на основе транскиптома модельного организма. Этот как бы индекс фактически граф Де Брейна для транскриптома. Поиск рида в транскиптоме сводится к разбивке каждого рида на к-меры и поиске пути в графе Брейеа для этих к-меров. Развилки в графе представляют собой различные изоформы гена. После того как все риды попытаются с переменным успехом отмапить на транскриптом можно посчитать сколько ридов приходится на каждый транскрипт. А вот далее мне совсем не понятно. К чему применяется бутстрэп? Как имея даже ОДИН образец Каллисто в паре с R строит для каждого транскрипта график "ящик с усами"? Мистика.

За час на риды мапятся на геном (мышка/человечек), BAM файл сортируется и индексируется (опционно), из БАМа вытаскивается GTF. когда все образцы отмапятся все GTF сливаются один общий GTF. Затем в бой вступает StringTie. Он пытается на основе ридов и общего GTF построить транскрипты (разные изоформы). А на основе этих транскиптов Ballgown считает статистику, строит таблицу DE генов, вулканчики всякие рисует и прочие свистульки и погремушки. Чем собственно и богат Биокондактор. На общем фоне все эти R приблуды выполняются практически мгновенно.

new Tuxido = HISAT2 + StringTie + Ballgown

Биться за скорость не вижу уже особого смысла. Скорость и так вполне приемлемая.
Примерно 1час/обоазец на i5 (4 core) 16 Gb RAM. Не считая дополнительного времени на QC.

SSD быстрый если только сравнивать с HDD. А если сравнивать с RAM DDR4 то это черепаха. Да и умрет SSD через неделю от такого свопа. Поэтому у меня на SSD стоит только Ubuntu и OS X Sierra. А все данные и своп на втором диске HDD.
Я сделал свой индекс без опций. И все взлетело. Весь протокол нового Туксидо отработал без ошибок и нашел все DE гены. И в IGV все загрузилось и просто летает. Всем спасибо.
А Hisat2 vs STAR это уже вопрос религии. У меня только 16Gb RAM делать апгрейд памяти только под STAR не вижу смысла.

С опциями --ss и --exon мой комп выбирает весь RAM потом весь своп и впадает в анабиоз. Без этих опций довольно шустро генерит индексные файлы. Oсталось выяснить глубинный смысл этих опций и что без них я теряю.
Как вариант я попробовал отмапить риды только на одну хромосому(наиболее мне интересную). Осталось придумать как вытащить из GTF на весь геном подмножество GTF на эту хромосому.

2 ksm
Тут какае то путаница. Попытаюсь разобраться.
Я скачал по вышей ссылке индексы, и скормил их Хайсат2 на РНК-сек данных рыбок. Хайсат2 скушал их и сгенерил мне BAM файлы с элайментом. Но эти файлы не загружаются в IGV . Вьюер ругается, что нет в БАМах информации о генах . Скорее всего индексы сделаны неправильно.
Я делаю по статье
Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie, and Ballgown
Mihaela Pertea1,2, Daehwan Kim1, Geo Pertea1, Jeffrey T. Leek3, and Steven L. Salzberg1,2,3,4
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5032908/

В ней во втором боксе инструкция как получить свои индексы (на примере chrX) :

$ extract_splice_sites.py chrX_data/genes/chrX.gtf > chrX.ss
$ extract_exons.py chrX_data/genes/chrX.gtf > chrX.exon

Second, build a HISAT2 index:

$ hisat2-build --ss chrX.ss --exon chrX.exon
chrX_data/genome/chrX.fachrX_tran



Индексы без анотации для меня бессмыслены. Тем более, что полученые с помощью их файлы не грузятся в IGV. В чем я неправ?
На сайте Хайсат2 можно скачать готовые индексы. К каждому комплекту прилагается скрипт на Баше как эти индексы сделаны. этот скипт можно немного поправить и адаптировать к нужному геному. По моему самый правильный путь.

Причем тут Стар? Ему нужно только 30Гб для мапинга. А на Хайсате 8Гб (16 Гб с запасом).
А индексы один раз сделал или скачал и пользуйся ими потом всю жизнь. Мне Хайсат2 нравится за офигенную скорость и связку в новый Туксидо. Думаю на ближайшие лет 5 это станет де факто стандартом для РНК-сек (ИМХО).

2 ksm
Конечно это индекс. Только не полный индекс генома зебрафишки. Какаето его часть. В принципе можно и для одного гена строить индекс и мапить на него геном. А за наводку на индекс генома спасибо. Еще бы узнать на какой сборке генома он получен.

Всем привет.
У меня появилась нужда выровнять риды на зебрафишный геном danRer7.fasta
с помощью HISAT2. Геном в два раза меньше человечьего, но тоже не маленький.
Не могу никак найти готовый (пригодный для HISAT2) индекс к этому геному. В описании программы пишут, что для индексирования надо примерно 150Gb RAM на борту компа. У меня немного меньше . Может у кого завалялся готовый индекс или хотя бы суперкомпьютер. Буду премного благодарен за иднексирование для HISAT2 зебрафишного генома.

Я еще застал на факультете ВМК МГУ такой зоопарк

Таких было чертовски мало. Всякие луноходы программировали. Всем остальным хватало Фортрана и Алгола.
А олимпиадные задачки в книжке действительно сложные попадаются.

Случайно наткнулся на задачник

Всем привет.
Когда говорят о длинне гена, что имеют ввиду? Суммарную длинну всех екзонов и интронов? или туда еще включают 5'/3' UTR?
И в чем смысл описания не кодирующих белок экзонов?

Зайдите на Ютьюб и сделайте запрос на "Константин Северинов".
И вы убедитесь, что за последние 10 лет Константин не сказал ничего нового.
Ни американский ипотечный кризис, ни цены на нефть, ни великая рецессия его не трогают.

https://www.youtube.com/watch?v=PiBNZubtLsg
Константин Северинов о жизни научной диаспоры в новых российских реалиях

Если образцов десятки-сотни трудоемкость разко возрастает. В топку.

Может да, а может и нет. Все от праймеров зависит.
Для сиквенса требования для праймеров более жесткие чем обычно для ПЦР.
Посмотрите, например протоколы Колд Спринг Харбор для баркодирования.
Эти протоколы спецально для школьников разрабатывались. Для чайников.
Для баркодирования в ПЦР берут смесь длинных вырожденных праймеров, подходящих практически для всех растений. У всех прямых праймеров на 5' конце последовательность M13 Dir. А у всех обратных праймеров M13 Rev. После ПЦР на геномной ДНК выделяют нужную полосу из геля и шлют на сиквенс с M13 (Dir/rev).
Школьники так и растения и животных и инсектов баркодируют. История даже попала в прессу после того как эти тимуровцы прошлись по рыбным ресторанам Нью-Йорка и выявили жульничество с заменой дорогой рыбы на дешовые сорта.