molbiol.ru -> Выделение кардиомиоцитов

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Выделение кардиомиоцитов

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

гость: K
IP-штамп: fr.g7TFubySDA
гость

09.08.2005 15:23

URL #1

Возник вопрос - работал ли кто с выделением кардиомиоцитов, для дальнейшего культивирования их или работы с живыми клетками? В частности, интересуют мышки и морские свинки, но остальные тоже подойдут. Просто хотелось бы узнать подробности методик для выделения, обсудить возможные траблы. (Сам выделяю их из мышек на системе Лангердорфа, с каллагеназой 2 типа и с протеазами...)

Kosta

Piter-Bern

09.08.2005 15:27

URL #2

Это был мой вопрос... Kosta

Варя
Участник

17.08.2005 13:23

URL #3

выделяю из крысят и мышат 1-4 дня после рождения,использую коллагеназу А в разных концентрациях. У вас взрослые животные?В течение какого времени культивируете после выделения? Ньюансов много-лучше по почте. zv20@yandex.ru

Варя
Участник

17.08.2005 13:24

URL #4

smirnovatatiana
Участник
Москва

22.08.2005 00:19

URL #5

я тоже пока с новорожденными, с ними проблем нет вообще никаких (ну разве что трипсин хороший нужен), могу скнуть протокол. со взрослыми осенью хочу сделать, протокол с комментариями опять же могу дать, но я его пока не проверяла

Kosta

Piter-Bern

24.08.2005 17:52

URL #6

Мы вообще их не культивируем пока что после выделения. Может быть потом надо будет. Пока что работаем с ними в течении дня. Животные у нас взрослые - от нескольких месяцев.
Просто даже на этом этапе клеток оказывается не всегда достаточно, чтобы с ними работать. И о культивировании говорить не приходится. Наверное с новорожденными немного иначе - если у нас сердце приходится насаживать на cannula под микроскопом, то у новорожденных этого, пожалуй, не сделаешь. Хотя познакомиться с методикой было бы интересно - может что использовать можно будет.
А трипсином мы не пользуемся (частично по традиции, частично, чтобы потом не доказывать, что он может что-то расщеплять). А протокол - буду рад глянуть (может что и у себя изменю)
Kosta.

Сообщение было отредактировано Kosta - 24.08.2005 17:54

Guest
IP-штамп: frMsTDflcGfck
гость

26.08.2005 16:29

URL #7

надо:
наркоз и проч для забоя, стерильный инструмент, ч.петри для начальной промывки сердца
стекла покрытые фибронектином

сама установка для перфузии, в нашем исполнении это (дурдом такой специальный):
куча шлангов от установки для переливания крови (стерилизуются кипячением)
перистальтический насос
манометр (сама эта хрень со шкалой на шланге; у бабушки забрала ;-).
"тройник" для шлангов, чтобы этот манометр туда вставить (от того же бабушкиного комплекта, та деталь от стетоскопа куда входят 2 трубки от ушей и выходит одна к мембране) с приклеенными к нему трубочками - переходниками.
трубка проходит несколькими петлями через водяную баню 37С
все это стерильно
на конце канюля из трубочки для коктейля

кислородная подушка

растворы:
1. базовый буфер:
0,5л воды (milliQ)
3,5g NaCl
215mg KCl
184mg NaHCO3
95mg KH2PO4
100mg MgCl2*6H2O
595mg HEPES
2мл 10%рра глюкозы из аптеки
2. среда:
199 среда с 10%FCS
инсулин 5мкг/мл
антибиотики по вкусу
3. буфер с гепарином
4. буфер с коллагеназой тип1 sigma 1мг/мл, объем зависит от объема перфузионной системы (10-15мл)
5. (досыпается туда же уже в процессе, на 15 мл 4го рра):
7мг коллагеназы
100мг BSA
15мкл 10%CaCl2

порядок действий:
0. оксигенировать все растворы
систему заполнить буфером
сердце выделить и промыть в буфере с гепарином
...
(далее пересказываю протокол из дисс. Амченковой 1989г)
1. одеть сердце на канюлю, привязать, перфузия через аорту (давление не более 70мм рт ст) рром3 , 3-5мин
2. 15 мин перфузия рром 4 (под сердцем стоит пластиковый стаканчик, в него кислород из подушки все время) по замкнутому циклу
3. досыпать в стаканчик все из пункта 5 и еще перфузировать 2-3мин
4. срезать с сердца (прямо на канюле) желудочки, разрезать на несколько частей, на мешалку в стаканчике который под сердцем стоял в 1/3 последнего объема
каждые 15 мин сливали р-р и добавляли новый, первый слив выливали т.к. шмер сплошной
5. сливы с клетками можно фуговать или ставить в +5С пока сами не осядут
6. слить надосадочную жидкость, залить средой2.
смена среды через 48ч на такую же.

smirnovatatiana
Участник
Москва

26.08.2005 16:32

URL #8

во-первых это я, во-вторых это про взрослых крыс.

gost'
IP-штамп: frW9K5ko0Biws
гость

30.08.2005 01:10

URL #9

Я извиняюсь, а для чего сердце надо перфузировать? Чтобы удалить клетки крови?

Kosta

Piter-Bern

30.08.2005 15:48

URL #10

Сердце перфузируют, чтобы предотвратить ее свертывание и образование тромбов. Это может помешать перфузии ферментов через коронарные сосуды и ухудшению конечного результата. Для этого же в системе перфузии (в частности, Лангердорфа) используют отвод для пузырьков, которые так же могут закупорить сосуды.

Kosta

Piter-Bern

30.08.2005 16:38

URL #11

У меня другой вопрос - насколько критично насыщение растворов кислородом и использование БСА? Мы, поначалу, тоже пробулькивали кислород через растворы на Лангердорфе. Но потом перестали, поскольку разницы особой не заметили (может надо снова попробовать). Потом мы здесь БСА никогда не добавляли (почему, например, нельзя просто уменьшить концентрацию каллагеназы?)...
P.S. Хотя насчет перфузии сердца - видел в нете методику, где действительно сердце не перфузируют, а нарезают на кусочки, а потом меняют растворы. Но там у них какие-то свои растворы фирменные были, состав которых непонятен...

Kosta

Piter-Bern

30.08.2005 16:43

URL #12

Прикрепляю фрагмент статьи, где тоже описан вариант выделения клеток и культивирования (для кроликов), но сходная процедура и для других (крыс, морских свинок)

Файл/ы:

Isolation_copy.pdf
размер: 429.02к
кол-во скачиваний: 7
30.08.2005 — 06.09.2005

nigoal123
IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE
гость

23.05.2022 12:02

URL #13

The secret to 123GOAL good article writing is to 11hilo understand how สล็อต123 to plan and structure a บาคาร่าออนไลน์ piece before slotxo you write it.

A well-structured ลิงค์รับทรัพย์ article allows you to use nigoal your writing skills to sexy gaming best advantage and dreamgaming communicate your ideas nigoal 50รับ100 correctly, concisely, clearly, coherently, and completely.

nigoal123
IP-штамп: frAafNuYANUh2
гость

24.05.2022 09:01

URL #14

Depending on who you talk to 123GOAL you’ll hear SEO described as slotxo anything from a mysterious สล็อต process that magically results สล็อต123 in an organic traffic spike บาคาร่าออนไลน์ to a simple checklist of things

to do before you hit publish nigoal And while Google ลิงค์รับทรัพย์ continues to update its sexy gaming want to read it. nigoal 50รับ100 algorithm over the years dreamgaming to help out searchers

guest: 123
IP-штамп: frJhOCvSv9ICE
гость

02.06.2022 12:21

URL #15

For years there 123VEGA have been FA CHAI SLOT calls for Asia - which JILI SLOT is home to some PRAGMATIC PLAY of the world's สล็อตPG biggest CO2 emitters - to ditch fossil fuels 11HILO to help tackle climate AMB CASINO change. Countries in the region - including FC SLOT its three biggest economies 88KTC China, Japan and India - were criticised last year 123GOAL for not making a bigger.

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.