Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Coloney |
Картинки: ogur3.jpg — (79.63к) ogur2.jpg — (96.83к) ogur1.jpg — (75.21к) |
ksm Постоянный участник |
|
LMP Постоянный участник |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Могли ошибиться с концентрацией магния в сторону увеличения до 4-6 мМ, например?. |
Horse-radish Участник |
зы: 2я картинка как то плохо выглядит, лучше выбрать новые праймеры. Сообщение было отредактировано Horse-radish - 01.11.2017 12:02 |
Coloney |
(LMP @ 01.11.2017 12:55) Похоже на неспецифику. То, что у вас реагенты везде одинаковые имело бы значение лишь в том случае, если бы вам плашку капал робот. С другой стороны, может быть неравномерный прогрев плашки? Краевые лунки от центральных отличаются? Нет, крайние лунки от центральных не отличаются, плашка прогревается равномерно |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Coloney, пишите в деталях как раскапываете. |
Coloney |
(-Ъ- @ 01.11.2017 12:57) Условия реакции все же изменились, что привело к сильной димеризации праймеров и блокировке синтеза PCR продукта. Могли ошибиться с концентрацией магния в сторону увеличения до 4-6 мМ, например?. концетрация магния надеюсь постоянная, потому что ипользуется буфер от Thermo Scientific содержащий магний |
LMP Постоянный участник |
(-Ъ- @ 01.11.2017 09:57) Мож мастермикс как-то не так хранили?...
|
Coloney |
(-Ъ- @ 01.11.2017 13:35) Ребята, да нет же, повнимательнее почитайте вопрос ТС и к тому же дана в качестве "контроля" идеальная, на мой взгляд, картинка. Все ОК, но не постоянно - сегодня хорошо, а на следующий день - одни димеры. Ничего не меняет. Coloney, пишите в деталях как раскапываете. В деталях готовиться буфер для реакции на 500 мкрл, раскапывается с помощью степпера от eppendorf по 5 мкрл в 96-луночный планшет, после этого добавляется днк дозатором на 5 мкрл, итого получается около 10 мкрл смеси в каждой лунке, заклеил пленкой и в "печь". Протокол для реакции ставится постоянно одинаковый. Вот идея с концентрацией хорошая, праймеры новые пришли, хоть и разбавлены по инструкции производителя, проведу реакцию с уменьшенной концентрацией и отпишу |
LMOG |
нанесите образцы на гель и посмотрите размеры полос. днк какая и в какой концентрации берется? и что вообще ПЦРится? судя по каринкам у вас не только димеры, но и сами продукты вариабельного размера (каринка 3) |
Coloney |
(LMOG @ 01.11.2017 14:00) 10 мкл не лучший объем реакции. будет бОльшая вариабельнось результатов при раскапывании и тп. нанесите образцы на гель и посмотрите размеры полос. днк какая и в какой концентрации берется? и что вообще ПЦРится? судя по каринкам у вас не только димеры, но и сами продукты вариабельного размера (каринка 3) Какой объем реакции будет стабильнее? 8 мкрл? Реакция ставится на растениях, действительно вариабельность есть, концентрация ДНК не одинаковая но в определенных пределах 200-600 нм, в среднем 300-350 нм если верить прибору Simpli nano |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Как выделяете ДНК (метод, кит), какая "печь" у Вас в работе, а какие пленки используете для запечатывания плашек? Разная ДНК по чистоте и количеству (что такое 200-600 нм ???), конденсат на стенках пробирок к концу реакции, испарение из-за плохого контакта пленки - основные причины появления димеров и как следствие подавления основной реакции. Перед "печкой" плашки положено фуговать для сброса капелек на дно. л,л,л, мл,мл,мл, мкл,мкл,мкл. |
ship Постоянный участник Moscow |
(Coloney @ 01.11.2017 11:30) Какой объем реакции будет стабильнее? 8 мкрл? Реакция ставится на растениях, действительно вариабельность есть, концентрация ДНК не одинаковая но в определенных пределах 200-600 нм, в среднем 300-350 нм если верить прибору Simpli nano 20 мкл или 25 мкл. |
ksm Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |