Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
ernesta88 Постоянный участник москва |
по расчетам на экспази белок вроде должен весить около 40 кДА а выделяца кусок - ну хорошо если тридцать кДа! выделяла несколько раз, антител к нему нет но сиквенс полностью сделан все нормально в плазмиде в смысле. чтоб проверить та это плазмида иле нет периодически ставлю с ней пцр и делаю рестрикционный анализ - все то контаминации нет. выделяю в денатурирующих условиях. протеолиз в бактериальной клетке думаю маловероятен потому что вдобавок красила гель красителем который красит токо белки с гистегом (инвижн инвитроджен гистэг стэйнин солюшн) - никаких промежуточных продуктов не видно (плюс штамы дефектны по протеазам) сразу начинает синтезировацо ЭТО на 10 кда меньше чем положено...вот не пойму почему да. Возможно ли что электрофоретическая подвижность белка так сильно отличаеца от его массы??? |
guest: ммм IP-штамп: frAPvARYpK7kw гость |
Возможно. Сделайте MALDI |
ernesta88 Постоянный участник москва |
(guest: ммм @ 14.03.2010 22:49) --Возможно ли что электрофоретическая подвижность белка так сильно отличаеца от его массы??? Возможно. Сделайте MALDI а чиво такое малди? нет прямой ссылки??? простите можыт тупые вопросы но просто времени в обрез просто нет времени уж искать все это в инете все адно спасибо! щас папробую можыт найдецо сразу |
Guest IP-штамп: fr0zIN0QqkqBg гость |
|
ernesta88 Постоянный участник москва |
(Guest @ 14.03.2010 23:34) на языке волнения |
guest: ммм IP-штамп: frAPvARYpK7kw гость |
|
ernesta88 Постоянный участник москва |
(guest: ммм @ 15.03.2010 00:02) дда нашла тоже в википедии ... впрочем если форез с додецилсульфатом то там же вроде все факторы кроме массы сведены к минимуму... правда я не кипячу образцы и не перевожу их из мочевины никуда но до сих пор все было нормально без всякого кипячения и диализа... |
guest: ммм IP-штамп: frAPvARYpK7kw гость |
На подвижность влияет заряд, если он кислый с низким pI, то подвижность выше. Если не кипятите, то могут остаться S-S связи, которые уменьшают гидродинамический радиус белка и следовательно увеличивают подвижность |
RJ Dio Постоянный участник |
|
ernesta88 Постоянный участник москва |
типа если экспрессия низкая он выделяется вместо (или вместе) рекомбинантного белка вот тут про него написано, может это общеизвестный факт но как-то только что про это узнала:
|
gost' IP-штамп: frE1krxZbrc3w гость |
|
gost' IP-штамп: frE1krxZbrc3w гость |
только если бы енто спасало.... как абсолютно правильно написано "типа если экспрессия низкая он выделяется вместо (или вместе) рекомбинантного белка" и спасет на 95% выделение в денатурирующих условиях, но тогда возникает проблемма рефолдинга вот так вот.... |
RJ Dio Постоянный участник |
|
Alex2006 Постоянный участник Берлин |
|
Fritz Постоянный участник Москва |
|
ernesta88 Постоянный участник москва |
(gost' @ 15.04.2010 22:56) да умен д-0с умен нет слофф... только если бы енто спасало.... как абсолютно правильно написано "типа если экспрессия низкая он выделяется вместо (или вместе) рекомбинантного белка" и спасет на 95% выделение в денатурирующих условиях, но тогда возникает проблемма рефолдинга вот так вот.... фу *ля! извините gost! чота хотела узнать что значит крокодил в красном круге и невольно отметила ваше сообщение как спам ыыы ! |
guest: sss IP-штамп: frdUy3lbElG8Y гость |
|
Fritz Постоянный участник Москва |
|
слоненок Участник Москва |
|
ernesta88 Постоянный участник москва |
(Daemonarchestratygos @ 15.04.2010 21:01) Какой коварный Sly D! Ну что ж, способ борьбы с ним, надо думать, весьма прост и не требует покупки кобальт-содержащего сорбента: достаточно отмыть сорбент от Ni2+ и загрузить NTA-агарозу Со2+. вот тогда вопрос, а как вы загружаете? то есть берете например протокол reuse of никель-нта из экспрессиониста только в конце загружаете ее например сульфатом кобальта? Или годится любая другая соль кобальта? или может достаточно просто снести с новой никель-нта никель с помощью ЭДТА и загрузить кобальтом? И как эта "загрузка" вообще происходит, то есть просто носитель инкубируется с соответствующей солью определенное время?? |
Guest IP-штамп: fr9wQhdAvy73Q гость |
Однако как говорилось раньше если продукция белка маленькая енто не спасет..... |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(Guest @ 04.06.2010 20:38) я тоже подумал - действительно, а что может быть проще мычания! Спасибо за хорошее настроение! |
ernesta88 Постоянный участник москва |
|
Daemonarchestratygos Постоянный участник |
(ernesta88 @ 05.06.2010 16:06) |
ejteuzso Россия |
На подвижность влияет заряд, если он кислый с низким pI, то подвижность выше. Если не кипятите, то могут остаться S-S связи, которые уменьшают гидродинамический радиус белка и следовательно увеличивают подвижность |
Poisk |
(ernesta88 @ 14.03.2010 22:34) Вот, выделяю белок с полностью отсеквенированной плазмиды по расчетам на экспази белок вроде должен весить около 40 кДА а выделяца кусок - ну хорошо если тридцать кДа! выделяла несколько раз, антител к нему нет но сиквенс полностью сделан все нормально в плазмиде в смысле. чтоб проверить та это плазмида иле нет периодически ставлю с ней пцр и делаю рестрикционный анализ - все то контаминации нет. выделяю в денатурирующих условиях. протеолиз в бактериальной клетке думаю маловероятен потому что вдобавок красила гель красителем который красит токо белки с гистегом (инвижн инвитроджен гистэг стэйнин солюшн) - никаких промежуточных продуктов не видно (плюс штамы дефектны по протеазам) сразу начинает синтезировацо ЭТО на 10 кда меньше чем положено...вот не пойму почему да. Возможно ли что электрофоретическая подвижность белка так сильно отличаеца от его массы??? мРНК плазмиды смотрели на предмет покодонной разбивки? Это может иметь отношение к уменьшению кДа, если проверить соотношения кодоны-аминокислоты-стОпы. Могла быть ранняя остановка синтеза белка за счет перекодировок некоторых кодонов аминокислот на стОпы. Это приведет к уменьшению кДа. Белок секвенировали? |
MVV California |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |