molbiol.ru -> если масса рекбелка отличается от расчетной на 10 кда?

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* если масса рекбелка отличается от расчетной на 10 кда?

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

ernesta88
Постоянный участник
москва

14.03.2010 21:34

URL #1

Вот, выделяю белок с полностью отсеквенированной плазмиды
по расчетам на экспази белок вроде должен весить около 40 кДА
а выделяца кусок - ну хорошо если тридцать кДа!
выделяла несколько раз, антител к нему нет но сиквенс полностью сделан все нормально в плазмиде в смысле. чтоб проверить та это плазмида иле нет периодически ставлю с ней пцр и делаю рестрикционный анализ - все то контаминации нет.
выделяю в денатурирующих условиях. протеолиз в бактериальной клетке думаю маловероятен потому что вдобавок красила гель красителем который красит токо белки с гистегом (инвижн инвитроджен гистэг стэйнин солюшн) - никаких промежуточных продуктов не видно (плюс штамы дефектны по протеазам) сразу начинает синтезировацо ЭТО на 10 кда меньше чем положено...вот не пойму почему да. Возможно ли что электрофоретическая подвижность белка так сильно отличаеца от его массы???

guest: ммм
IP-штамп: frAPvARYpK7kw
гость

14.03.2010 21:49

URL #2

--Возможно ли что электрофоретическая подвижность белка так сильно отличаеца от его массы???

Возможно. Сделайте MALDI

ernesta88
Постоянный участник
москва

14.03.2010 22:25

URL #3

(guest: ммм @ 14.03.2010 22:49)

а чиво такое малди? нет прямой ссылки???

простите можыт тупые вопросы но просто времени в обрез просто нет времени уж искать все это в инете

все адно спасибо! щас папробую можыт найдецо сразу

Guest
IP-штамп: fr0zIN0QqkqBg
гость

14.03.2010 22:34

URL #4

На каком языке пишет топикстартер?

ernesta88
Постоянный участник
москва

14.03.2010 22:36

URL #5

(Guest @ 14.03.2010 23:34)

На каком языке пишет топикстартер?

на языке волнения

guest: ммм
IP-штамп: frAPvARYpK7kw
гость

14.03.2010 23:02

URL #6

MALDI - это масспек для белков, такой

ernesta88
Постоянный участник
москва

14.03.2010 23:18

URL #7

(guest: ммм @ 15.03.2010 00:02)

MALDI - это масспек для белков, такой

дда нашла тоже в википедии ...
впрочем если форез с додецилсульфатом то там же вроде все факторы кроме массы сведены к минимуму...
правда я не кипячу образцы и не перевожу их из мочевины никуда но до сих пор все было нормально без всякого кипячения и диализа...

guest: ммм
IP-штамп: frAPvARYpK7kw
гость

14.03.2010 23:59

URL #8

--правда я не кипячу образцы и не перевожу их из мочевины

На подвижность влияет заряд, если он кислый с низким pI, то подвижность выше.

Если не кипятите, то могут остаться S-S связи, которые уменьшают гидродинамический радиус белка и следовательно увеличивают подвижность

RJ Dio
Постоянный участник

15.03.2010 12:17

URL #9

да еще -если белок аномально богат легкими аа типа глицина, то обычный расчет: число аах100 не совсем корректен

ernesta88
Постоянный участник
москва

15.04.2010 16:54

URL #10

меж тем думаю, может кому будет интересно, вкратце: выделяю рекомбинантные белки разной массы, выделяется как бы один (при этом промываю колонку буфером с рН=6.3 до упора) чуть больше 26 кДа. Дык вот судя по массе это Sly D, вроде единственный бактериальный белок который конкурирует с белками у которых гексагистидиновый тэг за связывание с Ni-NTA
типа если экспрессия низкая он выделяется вместо (или вместе) рекомбинантного белка
вот тут про него написано, может это общеизвестный факт но как-то только что про это узнала:
http://www.highbeam.com/doc/1G1-113185041.html

Поблагодарили (3): papa Karlo, Daemonarchestratygos, irina ts

gost'
IP-штамп: frE1krxZbrc3w
гость

15.04.2010 17:21

URL #11

кроме [slyd] таким же поганым образом ведет себя [q-antigen ] 40-42кДа

gost'
IP-штамп: frE1krxZbrc3w
гость

15.04.2010 21:56

URL #12

да умен д-0с умен нет слофф...
только если бы енто спасало....
как абсолютно правильно написано "типа если экспрессия низкая он выделяется вместо (или вместе) рекомбинантного белка" и спасет на 95% выделение в денатурирующих условиях, но тогда возникает проблемма рефолдинга вот так вот....

RJ Dio
Постоянный участник

15.04.2010 22:11

URL #13

замена иона на ион не даст ничего- принцип связывания на гисы тот же, а избирательности нет. Потому как гис-содержащие белки и на никеле чистят, и на цинке, и на кобальте, один хрен

Alex2006
Постоянный участник
Берлин

15.04.2010 22:43

URL #14

иногда выручает элюция градиентом имидазола. Соберите фракции, гляньте - возможно, афинность у вашего белка выше/ниже, чем у Sly

Fritz
Постоянный участник
Москва

16.04.2010 21:45

URL #15

А белочек не мембранный случаем?

ernesta88
Постоянный участник
москва

17.04.2010 22:41

URL #16

(gost' @ 15.04.2010 22:56)

фу *ля! извините gost! чота хотела узнать что значит крокодил в красном круге и невольно отметила ваше сообщение как спам ыыы !

guest: sss
IP-штамп: frdUy3lbElG8Y
гость

19.04.2010 13:36

URL #17

да хотя бы на p53 посмотрите, масса 43, а на геле 53. такое часто случается

Fritz
Постоянный участник
Москва

19.04.2010 14:19

URL #18

Вот тут по мембранным белкам приводят отличное объяснение наблюдаемого "феномена"
http://www.pnas.org/content/106/6/1760.abstract

Поблагодарили (2): Alex2006, YPD

слоненок
Участник
Москва

21.04.2010 20:21

URL #19

Девушка жжет! Сочетание научного и албанского - это что-то!

ernesta88
Постоянный участник
москва

04.06.2010 17:52

URL #20

(Daemonarchestratygos @ 15.04.2010 21:01)

Какой коварный Sly D! Ну что ж, способ борьбы с ним, надо думать, весьма прост и не требует покупки кобальт-содержащего сорбента: достаточно отмыть сорбент от Ni2+ и загрузить NTA-агарозу Со2+.

вот тогда вопрос, а как вы загружаете? то есть берете например протокол reuse of никель-нта из экспрессиониста только в конце загружаете ее например сульфатом кобальта? Или годится любая другая соль кобальта?
или может достаточно просто снести с новой никель-нта никель с помощью ЭДТА и загрузить кобальтом? И как эта "загрузка" вообще происходит, то есть просто носитель инкубируется с соответствующей солью определенное время??

Guest
IP-штамп: fr9wQhdAvy73Q
гость

04.06.2010 19:38

URL #21

Все просто как мычание : ЕДТА-5обьемов воды- 2-3 обьема любой хорошо растворимой соли кобальта - 5 обьемов воды- нужный буфер.
Однако как говорилось раньше если продукция белка маленькая енто не спасет.....

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

04.06.2010 19:46

URL #22

(Guest @ 04.06.2010 20:38)

Все просто как мычание

я тоже подумал - действительно, а что может быть проще мычания!

Спасибо за хорошее настроение!

ernesta88
Постоянный участник
москва

05.06.2010 18:06

URL #23

А ни у кого вообще нет случайно штаммов E.coli дефектных по SlyD?

Daemonarchestratygos
Постоянный участник

01.03.2018 21:38

URL #24

(ernesta88 @ 05.06.2010 16:06)

А ни у кого вообще нет случайно штаммов E.coli дефектных по SlyD?

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3127686/

ejteuzso

Россия

05.03.2018 20:16

URL #25

Poisk

27.03.2018 23:31

URL #26

(ernesta88 @ 14.03.2010 22:34)

мРНК плазмиды смотрели на предмет покодонной разбивки? Это может иметь отношение к уменьшению кДа, если проверить соотношения кодоны-аминокислоты-стОпы. Могла быть ранняя остановка синтеза белка за счет перекодировок некоторых кодонов аминокислот на стОпы. Это приведет к уменьшению кДа. Белок секвенировали?

MVV

California

01.04.2018 17:50

URL #27

Для ernesta88 у меня есть. Я в свое время делетировал SlyD-SlyX из BL21(DE3), C41(DE3), C43(DE3), BL21(DE3)star и XLblue

watchesbiz
Постоянный участник

20.11.2021 18:05

URL #28

https://www.uptrennd.com/post-detail/hints-...-watch~ODY3MDU2
https://anotepad.com/note/read/mqg8p5jm
https://www.crokes.com/replicarolexwatches/profile/
https://ko-fi.com/post/Watches-Shopping-Gui...-Watc-E1E13PZV9
https://www.merchantcircle.com/blogs/replic...x-Watch/1966540
https://www.nairaland.com/6427528/watches-s...de-finding-fake
https://www.vingle.net/posts/3587193
https://fortunetelleroracle.com/sport/replica-watches-280478
https://www.goodreads.com/story/show/132736...ake-rolex-watch
https://www.diigo.com/item/note/85twz/phwr?...2395edb2dac07ea
https://github.com/ReplicawatchesUK/Replica...ake-Rolex-Watch
https://www.reddit.com/user/Bestreplicawatc...ke_rolex_watch/
https://slashdot.org/submission/13306958/wa...ake-rolex-watch
https://www.wattpad.com/1030107359-replica-...guide-finding-a
https://www.instructables.com/member/Fakero...licPreview=true

watchesonline89
Постоянный участник

26.12.2022 11:33

URL #29

https://telegra.ph/Advantages-Of-Replica-Watches-08-03
https://issuu.com/home/published/_6_.docx
https://www.gta5-mods.com/paintjobs/watchesswiss
https://omegawatches89.onweb.it/
https://padlet.com/omegawatches89/je3eq9ol3xzmb9bp
https://www.pinterest.com/omegawatches89/
https://knowyourmeme.com/users/omegawatches89
https://bitcointalk.org/index.php?topic=76487.new#new
https://omegawatches89.blog.hu/
https://knowyourmeme.com/forums/general/top...f-so-why?page=1
https://penzu.com/p/c6f21f5d
https://www.reddit.com/user/omegawatches89/...are_so_popular/
https://www.vingle.net/posts/4647076
https://penzu.com/p/c68b65cc
https://diigo.com/0pige9

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.