![]() | ![]() ![]() |
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | ![]() NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
![]() ![]() ![]() |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость ![]() |
Считать кол-во аргининов и лизинов в калибровочном белке и опытном? В моём белке например аргининов всего 6. Да, нет, надо просто калибровать по своему белку. ![]() ![]() -- И если считать так, то его концентрация просто офигеть. Судя по форезу, это совсем не так. Надо учитывать их количество на мол. вес ![]() Не заморачивайся обычна ошибка не достигает величины более 50% - 100% ![]() И кстати, какие именно остатки красит R-250? Он не годится в Брэдфорд, а красит тоже самое. А в форезе он очень быстро достигает насыщения на градуировочной кривой. |
![]() Киев ![]() |
|
Гость IP-штамп: frQVZIqPyXv.U гость ![]() |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость ![]() |
--Бр. - основные и ароматические ак, а Лоури - пептидная связь Все не совсем так Брэдфорд тоже частично реагирует с пептидной связью(иначе он не был бы красителем для шелка, а Лоури вовсю реагирует с тирозином, метионином и цистинами(цистеинами). |
guest: Гость IP-штамп: fr/51DboosOPk гость ![]() |
![]() |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость ![]() |
1) По BSA/OVA и забить на все. 2) Берете ваш образец и диализуете его до победы с мембраной 10кДа против летучего буфера(низкой концентрации не более 20мМ) типа ацетат(формиат) пиридиния(аммония). Потом победно(несколько раз) лиофильно сушите во взвешенной таре. Узнаете вес сухого образца по нему колибруете Брэдфорд. 3) Все тоже самое, что и (2), но из тотального белкового экстракта вашего объекта. |
Guest IP-штамп: frv8Mvfo5WhfE гость ![]() |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость ![]() |
Я, нет. --И еще, вроде по данной методике оптическая плотность чистого раствора должна находится в р-не 1,3-1,5, а у меня она только 0,6. По какой методике и кем данной. Оптическая плотность? На какой длине волны? А еще я люблю остатки отюзанного Брэдфорд из кюветы на фильтровашку промокать. Если такое сделать с хлорной кислотой, то можно пожар устроить. |
Guest IP-штамп: frv8Mvfo5WhfE гость ![]() |
"Методы очистки белков" Скоупс. Длина волны - 465 нм. |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость ![]() |
Угу! Ну что я могу сказать по этому поводу. Например, величина приведена для не разбавленного в 2 раза реактива. Как написано в методике при измерении холостая проба фактически разводит реакитив в два раза, возможно вы измеряли разведенную пробы, а надо было не разведенную. Весы у вас возможно врут и там не 60мг. Кювета с длинной пути 0.5см вместо 1-ого. Ну и еще в книжке может быть опечатка и длина волны не та. Так что я бы попробовал в первоисточник глянуть Analytical Biochemistry v86 p.142;v79 p.544 |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость ![]() |
|
guest: Гость IP-штамп: frHWt7eplAB5c гость ![]() |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость ![]() |
Магний дает с фосфорной кислотой малорастворимые и нерастворимые фосфаты. |
Гость IP-штамп: frc42pI/STTbM гость ![]() |
|
Guest IP-штамп: frtqj.kwixseM гость ![]() |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость ![]() |
Похоже у вас фиговое качество кумаси. Далее: Иг дают на брэдфорде заниженный результат, если его калибровать по БСА раза в 1.5-2. Так что вам по любому БСА неподходит. Купите препарат общий(неспецефичный) имуноглобулинов того же зверя, что и ваши супер пупер антитела. Он сравнительно недорогой более того грубую фракцию ИгG легко самим просто выделить высаливанием сульфатом аммония из сыворотки крови. Да, и считатется, что 1мг/мл ИгG на 1см на длине волны 280нм дает экстинцию порядка 1.35-1.45. |
![]() Постоянный участник Россия ![]() |
|
![]() Постоянный участник Россия ![]() |
(Эмин @ 20.10.2007 14:52) Градуируйтесь по своему белку. И как это сделать, если коммерческих препаратов не существует, а до гомогенности еще не почистили? |
![]() Постоянный участник Россия ![]() |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость ![]() |
БСА и взять, хотите подороже возмите OVA. --И как это сделать, если коммерческих препаратов не существует, а до гомогенности еще не почистили? Никак. Что вы в таком случае измерять собираетесь. Смесь белков у каждого своя сорбция краски, для градуировки годится любой стандарт с известной концентрацией тотального белка. Естественно абсолютную концентрацию вы в любом случае будете измерять с некоторой не катастрофичной ошибкой. Зато относительную более менее корректно. --Кстати, а ЧСА как? Никак, так же как БСА. |
Гость IP-штамп: frStLqL5.YgBU гость ![]() |
Такой вопрос. Приготовили раствор кумасси G-250 для Брэдфорд (все строго по прописи: 100 мг кумасси да в 50 мл 95% спирта да в 100 мл 85% фосфорной и водой до 1 л), а он, зараза, не такой получчается, каким мы его хотим видеть. Ночь стоял, но даже после этого после фильтрации не то чтобы коричневым получился, а каким-то болтно-зеленым. Пробовали строить по нему калибровку по БСА, а там показатели что для 0.8 мг-1.4, что для 70 мкг-1.22. Калибровка в итоге префиговая. Есть подозрения по поводу фосфорной кислоты, что она вовсе не 85%, а чуть ниже. Хотелось бы узнать ее плотность при 20-25 С и проверить концентрацию, а справочника под рукой нет (и денсиметра нужного тоже). Подскажите пожалуйста цифрки! Заранее пасиб! |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость ![]() |
Абсолютно правильные предположения. -- Подскажите пожалуйста цифрки! Заранее пасиб! 1.684-85% 1.630-80% 1.655-82.5% |
Гость IP-штамп: frhK3pgc32wP. гость ![]() |
И еще: Что такое БСА? Это покупается или готовится? |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость ![]() |
Можно. --притом, что она экстрагирована натрий-фосфатным буфером РН=6? Это нормально буфер подходящий, только вам должна быть известна ее концентрация, определенная независимым методом типа(что там 430/280) или какой то другой способом. Собственно пероксидаза мерятся по собственной окраске, зачем ей Брэдфорд непонятно. --И еще: Что такое БСА? Это покупается или готовится? Бычий Сывороточный Альбумин. Купить сухой проще. Сделать самому раствор. |
Гость IP-штамп: frhK3pgc32wP. гость ![]() |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость ![]() |
По Сигме(Delincee, H. and Radola, B.J., Eur. J. Biochemistry, 52, 321–330, 1975.) 1мМ(44мг/мл) пероксидазы на 403 нм дает поглощение 100 единиц/см Возможно вам не нужен Брэдфорд, а для определния количества пероксидазы просто измерять поглощение на 403нм. Ну и еще учитыват поглощение на 275нм. |
![]() Постоянный участник ![]() |
Давайте без обяснений механизмов, а только эмпирику. Кислота способствует образованию коричневой формы красителя, чем ее больше тем тяжелее белку связать краситель в синий цвет. Если кислоты мало то исходный краситель имеет сильную синезеленую опалесценцию. А градуировчная кривая очень крутая с коротким линейным отрезком и быстро выходит на плато. Если кислоты много то раствор сильно коричневый и не имеет осинезеленой опалесценции, а градуировачная кривая пологая и сохраняет линейность до довольно высокой концентрации белка, но зато снижается ее чувствительность вплоть до полного отсутствия. Известно что фосфорная кислота склонна всасывать в себя воду, кроме того фосфорная кислота может иметь разную концентрацию и в товарном виде, пропись же раствора Брэдфорд написана для 85% кислоты, если в исходном растворе концентрация кислоты отличается от это цифры, возможны траблы. _____ Дополнения к данной теме. Эмпирика процесса как раз очень интересная. Я 2 дня промучился с получением раствора Бредфорд правильной. Теперь, зная немного процесс могу дать совет правильного приготовления раствора в 99% случаев :). Для начала Кумаси Р и Г по химизму сходны. Р отличается от Г только двумя метилированными остатками, отсюда его чувствительность по связыванию с белками ниже на порядок. Много препаратов Кумаси есть "грязными" по природе :), кроме того Кумаси сам плохо растворяется. Поэтому при растворении в кислоте о дает коричневый цвет за счет образования коллоидных частиц в кислой среде. При доведении смеси дистиллятом до нужного соотношения скорее всего коричневого цвета вы никогда не получите. Я не получил еще :). В лучшем случае капая понемногу можно получить сине-зеленоватый цвет, что отображает изменения коллоидного раствора. В большинстве случаев цвет будет грязно-синий или синий, и это мало чем зависит от "белков вокруг вас" (я вот когда готовил по локти был в этаноле) :). Правда это не совсем так, и я советую все вымывать спиртом для чистоты реактива. Но под конец синий оттенок в большинстве случае стерильного приготовления реактива обуславливается наличием взвеси частиц нерастворившиегося Кумаси. Перед доливанием дистилята раствор концентрирован, по мере разбавления коричневый цвет становится слабее и синева становится все заметнее, между коричневым и синим возникает ряд переходящих оттенков, включая зеленый, салатовый и др. (она была и в начале, просто не заметна при коричневой окраске). Полученный синий реактив легко превращается в коричневый при удалении не растворившегося реактива путем фильтрования (подойдет любой чистый кусок ватмана). После фильтрования вы получаете чистейший и прозрачнейший раствор коричневого цвета. ВОт он уже будет синеть при наличии белков очень заметно. При приготовлении и встряхивания раствора должна появляться легкая пеннистость. Это значит, что как минимум посуду вы познакомили со спиртом, так как не следует забывать, что смеси воды со спиртом (даже маленькой концентрации) уменьшают поверхностное натяжение и способствуют образования пенистой структуры воды. Реактивы лучше готовить в стеклянной посуде, так как с пластиком Кумаси прочно связывается и очень тяжело вымывается. Для экономии этилена, предварительно можно промыть посуду и кюветы пропиловым спиртом или другим, менее дефицитным. После каждого измерения обязательно промыть спиртом кювету, особенно это касается пластиковым кювет - без этого линейности калибровки вы никогда не получите. Вот в принципе и все. Если повторять все вышеописанное, реактив всегда будет одинаковый как и результаты. Удачи! |
![]() Постоянный участник ![]() |
Еще раз повторяю, что для калибровки вам нужен образец с заранее известной концентрацие пероксидазы. Даже если у вас есть лиофилизированный порошок и вы его собрались взвешивать его надо подсуить прерд взвешиванием в вакууме при температуре 50-60 градусов(возможно это убет ее, как фермент но сохранит окраску в брэдфорде. ____ Мы практиковали еще просушку белка для калибровки в роторном испарителе :) (навеску вдвое большую, чем надобно, помещали в фольгу и плотно заматывали, примеси туда при сушке почти не попадают, а водяная пара хорошо оттягивается через микрощели в фольге). Довольно неплохо получается. Легкий вакуум, 30 градусов, 40 минут - красота. |
![]() Постоянный участник ![]() |
Известно что фосфорная кислота склонна всасывать в себя воду, кроме того фосфорная кислота может иметь разную концентрацию и в товарном виде, пропись же раствора Брэдфорд написана для 85% кислоты, если в исходном растворе концентрация кислоты отличается от это цифры, возможны траблы. _______ Кстати, необязательно использовать именно 85% кислоту. Нужно пересчитать, какая в конечном растворе концентрация кислоты и исходить из этого. Правда это проверено для кислот с концентрацией 85 и более процентов. Я готовил из 95% кислоты. Если процент кислоты больше 85, то ее нужно брать меньше, а недостающий объем заменять водой, то есть, разводить прямо в реактиве. При кислоте меньше 85%, нужно брать больше килоты и меньше воды. Главное чтобы процент кислоты в конечном растворе не изменялся. |
Гость IP-штамп: frlbfbSqS0Xpc гость ![]() |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость ![]() |
Нет, эту проблему можно обойти. Внеся попавочный коэфициент. Кроме того чуть ли не 90% сывороточного белка - альбумин ошибка любого метода такова, что на его фоне определить колебания концентрации других белков нетривиальная задача. А раз там албуми основной белок, то калибровка по альбумину будет одной из самых адекватных. Так что я вообще не понимаю смысл мерить колебания общего белка в сыворотке. |
Гость IP-штамп: fr6a7wMX9KZzQ гость ![]() |
|
![]() Участник ![]() |
|
![]() ![]() |
|
![]() ![]() |
|
![]() ![]() |
|
guest: studenttka IP-штамп: frGqyYT8IU7LU гость ![]() |
|
![]() Постоянный участник ![]() |
|
![]() ![]() |
Преимущества: 1.никаких красителей и грязи, 2.белок нативен, 3.чувствительность в 0,01-0,1 мг/мл (в 10 р больше Бредфорд) 4."видит" хоть двух аминокислотные пептиды 5."видит" пептиды и белки с любым аминокислотным составом (а не как Бредфорд, который например не видит глутатион, потому что в нем нет лизина) Сама лично определяла в пробах методом Бредфорд и спектрофотометрическим при 205 нм: числа идут абсолютно параллельно, только при 205 они выше, так как Бредфорд не "видит" много белков и пептидов Могу дать ссылки если надо |
gest IP-штамп: fr.ReEIhc9B8A гость ![]() |
(katsu @ 14.10.2010 23:50) ![]() Преимущества: 1.никаких красителей и грязи, 2.белок нативен, 3.чувствительность в 0,01-0,1 мг/мл (в 10 р больше Бредфорд) 4."видит" хоть двух аминокислотные пептиды 5."видит" пептиды и белки с любым аминокислотным составом (а не как Бредфорд, который например не видит глутатион, потому что в нем нет лизина) Сама лично определяла в пробах методом Бредфорд и спектрофотометрическим при 205 нм: числа идут абсолютно параллельно, только при 205 они выше, так как Бредфорд не "видит" много белков и пептидов Могу дать ссылки если надо Жесть!!! Так можно мерить только в относительно чистых р-рах белка. Знаете, в аналитике есть такая хреновина, называется влияние матрицы? Так вот на 215, а особенно на 200 будет поглощать фигова туча соединений, многие из которых будут это делать сильнее, чем белок. |
![]() ![]() |
Это значит, что если что-то и поглощает в этом диапазоне (кстати, что?), то это уровень этого вещества в тканях столь же константен как и сам белок, а значит, даже с этим допущением эти цифры можно использовать для определения скажем относительной активности фермента в пересчете на белок. |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость ![]() |
Практически все, карбонаты, фосфаты, мочевина, ацетаты, бораты, трис, ацетон, аминокислоты, мочевина, формалин и тд |
Guest IP-штамп: fr0elurLgcEUY гость ![]() |
(katsu @ 15.10.2010 17:39) ![]() Сочувствую. Вы уже два года измеряете в гомогенатах концентрацию хрен-знает-чего на 200-215 нм, наивно полагая, что измеряете концентрацию белка, да еще и двумя методами. Какими, кстати? И в гомогенатах чего? Надеюсь не икры? (katsu @ 15.10.2010 17:39) ![]() Как Вам уже сказали, очень много всего. Кстати, Ваш вопрос ("кстати, что?) очень красноречив. Без обид. Вы плохо представляете себе физическую сущность аналитических методов, которыми пользуетесь. Вообще, мое ИМХО, измерение активности фермента в пересчете на белок в биосубстратах - это часто бессмысленная, но прочно устоявшаяся в биологии процедура. Мое предположение, что она перетекла в биологию из биохимии, где принято мерить удельную активность фермента в процессе очистки. Ну, в самом деле. Вы, к примеру, меряете активность фермента в гомогенате из хрен-знает-чего. В этом гомогенате, фермент составляет жалкую долю процента от всего белка. Поэтому можно просто тупо мерить активность в пересчете на вес того, что вы берете для гомогенизации. Главное, все делать единообразно. |
![]() ![]() |
|
![]() ![]() |
А пересчитывать на что-то надо, ибо каждая индивидуальная навеска нет-нет да и отличается по разбавлению и проч. в силу чисто технических причин. Я спрашиваю "кстати что?", потому что другие крупные биоорганические молекулы в этом диапазоне не поглощают. А остальные очевидно находятся в клетке на постоянном уровне, что и подтверждают мои данные о строгой параллельности данных полученных Бредфорд и по оптическому поглощению. |
Guest IP-штамп: fraS2pF4sBl5I гость ![]() |
(katsu @ 22.10.2010 22:40) ![]() Я спрашиваю "кстати что?", потому что другие крупные биоорганические молекулы в этом диапазоне не поглощают. Поглощают-поглощают, еще как. А еще очень много мелких молекул - гораздо сильнее (есть такая хрень - молярная экстинкция, а еще - закон Бугера-Ламберта-Бера). |
![]() ![]() |
А наш метод (довольно давно, кстати известный) более точен и с теоретической точки зрения и как я утверждаю с практической! |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость ![]() |
ЭЭЭ Нуклеиновые кислоты и на 200 поглощают. А претензий к методу на 280 не меньше чем к методу на 200. Им пользуются для чистых белков в основном. Для смесей так белок никто не измеряет. В УФ детекторах он используется потому что вы смотрите пики и все при чем в этих пиках может быть дикая смесь. После это фракции еще раз анализируют скажем форезом, Western'ом или другим более разрешающим методом. те в данном случае поглощение на 280 промежуточный ориентировочный результат. |
![]() Постоянный участник Москва ![]() |
(katsu @ 01.11.2010 16:08) ![]() А наш метод (довольно давно, кстати известный) более точен и с теоретической точки зрения и как я утверждаю с практической! Классы прошла межет быть все, а коридор точно нет... ![]() "Ваш метод" гениально прост. ![]() |
![]() ![]() |
1. Комплекс красителя с белком светочувствительный. 2. увеличение чувствительности возможно при уменьшении объема, но здесь возникает куча нюансов. 3. Многие белки плохо поглощают на 280 нм, микрограммы не обнаружить |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |
![]() ![]() ![]() |