Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Не идет реПЦР из геля
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Almost




 прочитанное сообщение 06.10.2018 18:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Доброго времени суток!
Столкнулись с проблемой, не идет реПЦР из геля.
Начну с начала. Ген x собран с нуля. Ставим пцр из лигированной смеси, на форезе яркий бэнд нужной длины плюс неспецифика-бледнее. Разводим пцр в 100 раз ставим репцр, на форезе яркий бэнд, неспецифики почти нет. Вырезаем нужный фрагмент (максимально быстро) -выделяем набором TF-ставим репцр из этой смеси, на форезе неспецифика по длине меньше гена, а нашего фрагмента нет!
Миллион пцр ставили тк трансформация не проходила, решили разобраться в чем проблема, на форезе смеси лигированной плазмида+ген-есть, видимо не закольцованная.
Есть мнение, что спирт (который идет как промывка у набора, хотя там не 96) скручивает концевые участки фрагмента, и возможно из-за этого не садятся праймеры.
В пцр полимераза iproof bio rad, буферы, наборы свежие. Размер гена 1600 пн

Сообщение было отредактировано Almost - 06.10.2018 18:36
Участник оффлайн! Mykhaylo
Постоянный участник
Україна



 прочитанное сообщение 06.10.2018 19:16     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Вырежьте, киньте в воду, и не морочьте себе голову выделениями. Ну можете заморозить-оттаить разок. А еще лучше поиграйтесь условиями с оптимизацией (банально с температурой отжига для начала) - пусть продукта будет меньше, но не будет необходимости резать из геля.
Участник оффлайн! Almost




 прочитанное сообщение 06.10.2018 19:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

(Mykhaylo @ 06.10.2018 20:16)
Ссылка на исходное сообщение  Вырежьте, киньте в воду, и не морочьте себе голову выделениями. Ну можете заморозить-оттаить разок. А еще лучше поиграйтесь условиями с оптимизацией (банально с температурой отжига для начала) - пусть продукта будет меньше, но не будет необходимости резать из геля.

Это сборка гена, неспецифики в любом случае будет тонна. А методика по заморозке не дает высокого выхода продукта для лигирования
Участник оффлайн! Mykhaylo
Постоянный участник
Україна



 прочитанное сообщение 06.10.2018 19:30     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Так не заморозку в лигирование, а репцр попробуйте на заморозке, без выделений, переосаждений и пр
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 07.10.2018 01:43     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

мы что обсуждаем-сборку гена или проблемы с китом для выделения днк из геля? Если последнее-поиграйтесь с "кошками", вырежьте абстрактную полосу, попробуйте реПЦРить, когда все наладится, переходите к боевым опытам
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 07.10.2018 01:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

спирт (который идет как промывка у набора, хотя там не 96) скручивает концевые участки фрагмента, и возможно из-за этого не садятся праймеры
Это новое слово в науке, Шнобелевкой попахивает
Участник оффлайн! genseq
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 07.10.2018 09:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Такие фокусы возможны. И именно из-за спирта. Он может содержать примеси ацетальдегида, который реагирует с аминогруппами оснований А и С. Реакция идёт быстро с однонитевой ДНК. У двунитевой реагируют только концевые основания, что приводит к медленному расплетанию концов. На форезе это расплетание можно не заметить, но при повторной ПЦР на такие концы праймеры не сядут. А если и сядут, то уже внутри ампликона, на неспецифичные участки связывания.

В старину реакция оснований с альдегидами использовалась в формалиновом методе оценки радиационного повреждения ДНК. Чем она сильнее повреждена, тем быстрее реагирует с формалином. Скорость реакции оценивалась по увеличению пика поглощения на 260 нм.

Вывод: не пейте этот спирт! rolleyes.gif
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 07.10.2018 15:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

это полная чушь. даже если что-то такое и имеет место, то сложно представить себе КОЛИЧЕСТВЕННОЕ прохождение такой реакции, чтоб ПЦР вообще не шел. Скажем, 90% прохождение даст отставание по циклам в 3 цикла всего, а тут... короче, лезвие Оккама вам в помощь. Типа у народа киты биорадовские есть, а спирт пущинский? Едва ли...Я бы скорее представил себе глубокое сжигание ДНК на УФ при вырезании, вполне реалистичный сценарий, если дать в руки скальпель студенту, по крайней мере я такое видел. Короче, надо потренироваться на модельной ДНК

Сообщение было отредактировано R-J-Dio - 07.10.2018 15:08
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 08.10.2018 00:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

задача переПЦРить некий и клонировать в плазмиду?

что вы подразумеваете под "трансформация не проходит"?

если не идет реПЦР - то скорее всего вы из геля вырезаете не то или гдето еще ошибка, а дело не в самой реакции.
клонируйте и сиквенинируйте тот ПЦР продукт который у вас нормально ПЦРиться, это может многое прояснить.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 08.10.2018 07:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

да не могут они, грязь, видите ли, у них. Вырезают из геля, клонируют-не растет. По той же, полагаю причине, что и не ПЦРится. Такие пироги...
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 08.10.2018 12:16     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(Almost @ 06.10.2018 19:31)
Ссылка на исходное сообщение  Доброго времени суток!
Столкнулись с проблемой, не идет реПЦР из геля.
Начну с начала. Ген x собран с нуля. Ставим пцр из лигированной смеси, на форезе яркий бэнд нужной длины плюс неспецифика-бледнее. Разводим пцр в 100 раз ставим репцр, на форезе яркий  бэнд, неспецифики почти нет. Вырезаем нужный фрагмент (максимально быстро) -выделяем набором TF-ставим репцр из этой смеси, на форезе неспецифика по длине меньше гена, а нашего фрагмента нет!
Миллион пцр ставили тк трансформация не проходила, решили разобраться в чем проблема, на форезе смеси лигированной плазмида+ген-есть, видимо не закольцованная.
Есть мнение, что спирт (который идет как промывка у набора, хотя там не 96) скручивает концевые участки фрагмента, и возможно из-за этого не садятся праймеры.
В пцр полимераза iproof bio rad, буферы, наборы свежие. Размер гена 1600 пн

"Трансформация не проходила" означает, что у вас не идет лигирование.
Встречный вопрос - неужели праймеры с гена используете, а не с плазмиды? Для таких тестов в хозяйстве нужно держать плазмидные праймеры.
А ПЦР и элюция из геля это потом, в конце концов, как Ронни предлагает, после тренировок на кошках. smile.gif
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 08.10.2018 12:20     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(genseq @ 07.10.2018 10:28)
Ссылка на исходное сообщение  Такие фокусы возможны. И именно из-за спирта. Он может содержать примеси ацетальдегида, который реагирует с аминогруппами оснований А и С. Реакция идёт быстро с однонитевой ДНК. У двунитевой реагируют только концевые основания, что приводит к медленному расплетанию концов. На форезе это расплетание можно не заметить, но при повторной ПЦР на такие концы праймеры не сядут. А если и сядут, то уже внутри ампликона, на неспецифичные участки связывания.

В старину реакция оснований с альдегидами использовалась в формалиновом методе оценки радиационного повреждения ДНК. Чем она сильнее повреждена, тем быстрее реагирует с формалином. Скорость реакции оценивалась по увеличению пика поглощения на 260 нм.

Вывод: не пейте этот спирт! rolleyes.gif

Сразу видно - прожженный насквозь старый самогонщик - ацетальдегид, метанол, изопропанол, но самая гадость - изоамиловый спирт. beer.gif
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 08.10.2018 17:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

А зачем вообще выделять из геля? В чём задача? С гелями всегда такой гимор, что лучше без них. Этидий бромид был в геле? Под ультрафиолетом жгли свою ДНК? 1600 иногда и нативная ПЦР-ится с трудом, а если повреждённая UV, то совсем худо. Спирт скорее всего ни при чём.
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 09.10.2018 06:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

это даже не обсуждается, разумеется. да сожгли днку просто-таки напростаки, и всего недолга
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  12.11.2021 19:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

https://wanelo.co/replicarolexwatches
https://musescore.com/fakerolexwatches
https://www.racked.com/users/Replicarolexwatches
https://sketchfab.com/Rolexrelicawatches
http://www.video-bookmark.com/bookmark/433...eplica-watches/
https://www.slideserve.com/ReplicawatchesUK...pt-presentation
https://www.theverge.com/users/Replicarolexwatches
https://www.yumpu.com/en/document/read/6532...lica-watches-uk
https://online.flippingbook.com/view/152275247/
https://www.instapaper.com/p/8767342
https://www.bigblueview.com/users/Replicarolexwatches
https://weheartit.com/watcheshutuk
https://sites.google.com/view/replicarolexwatches24/home
https://www.indiehackers.com/post/hints-on-...atch-113aef73a9
http://replicawatchesuk.esportsify.com/for...ica-rolex-watch

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 28.03.24 20:15
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft