molbiol.ru -> SDS-PAAG электрофорез белков. Помогите!

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* SDS-PAAG электрофорез белков. Помогите!

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Максим

30.04.2002 13:08

URL #1

Посоветуйте, где прочитать (желательно в Интернете) про азы белкового электрофореза-
устройство камеры, подготовка стекол, заливка геля.
Как сделать самому камеру для белкового фореза
Или объясните, если сочтете возможным.
Есть большой опыт ПААГ-эл.фореза фрагментов ДНК.
С уважением, М. Хаснатинов.

30.04.2002 13:29

URL #2

посмотрите здесь на сайте, мне в свое время помогло
http://molbiol.ru/protocol/17_01.html

30.04.2002 13:30

URL #3

P.S. А камера такая же, как для ДНКовых гелей.

aleksm
Постоянный участник

30.04.2002 16:02

URL #4

Почитайте еще Остермана Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М: Наука. 1981.
Книжка старая, но лучше пока никто ничего не написал. Все разжевано и объяснено до мелочей. Но в ней кое-чего по классическому форезу не хватает.
Пробелы можно восполнить из соотв. разделов книжек "Практическая химия белка" М:Мир. 1989. и
Методы иммунологических исследований. М:Мир, год не помню (Есть три книги под этим названием. Эта, кажется, первая)

Вольдемар

30.04.2002 23:18

URL #5

Основная проблема состоит в том (мне так кажется), что TRIS-GLY буфер плохо идет по фильтрам, поэтому стекла для белкового фореза надо успользовать с "ушками" (если подробнее, то пишите - объясню), а камеру - закрытого типа, лучше с внутренним охлаждением, или с охлаждением за счет собственного буфера. Леммли, как правило, заливают на 20*20, или маленьких стеклах 5*7
Форезники продаются в Хеликоне (ОЧЕНЬ дорого,- около 300 гр), но можно снять у знакомых размеры и заказать у умельцев.
Надеюсь поможет, Владимир Баскунов

AVS
Постоянный участник
UK - Russia

01.05.2002 01:52

URL #6

Никаких проблем не будет, если уже есть опыт ПААГ с ДНК. Разница в буферах, денатурирующих агентах - несущественно. Основное отличие - геля два в одном. Разделяющий - внизу и концентрирующий сверху, на треть от общей длины. А чтобы граница между ними хорошая была, после заливки разделяющего можно спиртика наслоить

petr
Постоянный участник

02.05.2002 14:45

URL #7

А я водичку наслаиваю

Olezhek
Постоянный участник
Tsukuba, Japan/КФУ, РФ

02.05.2002 16:16

URL #8

Уважаемые знающие люди,
у меня возникла задача увидеть какие белки присутствуют, а какие отсутствуеют в двух сравниваемых группах живности одного вида на разных этапах развития и под действием разных веществ. И для того чтобы решать кидаться с головой в DD и subtraction для начала появилась идея посмотреть на белковом электрофорезе визуальное присутствие или отсутствие тех или иных белков в обеих группах.. Посоветуйте пожалуйста, как можно добиться хорошего визуализирования такого вот total protein фореза и как поудачнее растащить белки по размеру на геле...
заранее спасибо...

guest123
Участник

02.05.2002 16:27

URL #9

Udachno razdelit' belki po razmeru mozhno na gradientnom gele.

petr
Постоянный участник

03.05.2002 21:51

URL #10

Да, уж тогда или градиентный гоните, или двумерный. Удачи.

petr
Постоянный участник

04.05.2002 10:24

URL #11

Или двумерный с градиентного - еще лучше!

Olezhek
Постоянный участник
Tsukuba, Japan/КФУ, РФ

04.05.2002 23:53

URL #12

Ух я сегодня с 10 вечера возился с окрашиванием.. .все сделал так как на этом сайте написано - СBB для начала пробую красить... в общем после 3-х часов окраски как-то плохо все отмывается - все равно фон остался серьезный и чувствительность очень мала...трудно...серебром попробую завтра..

vb
Постоянный участник

06.05.2002 05:14

URL #13

Максим, обрати внимание на литературу, посоветованную aleksm. Из доступного это действительно самое то. Если не найдешь, то попробую частично отсканить самые нужные места.
А что гонишь?
Олег

stask
Постоянный участник
Грозный - Москва - Stony Brook - ...

08.05.2002 12:22

URL #14

<blockquote><font size="1" face="Verdana, Helvetica, sans-serif">цитата:

Автор - Olezhek:
Ух я сегодня с 10 вечера возился с окрашиванием.. .все сделал так как на этом сайте написано - СBB для начала пробую красить... в общем после 3-х часов окраски как-то плохо все отмывается - все равно фон остался серьезный и чувствительность очень мала...трудно...серебром попробую завтра..

</blockquote>
В смысле красили 3 часа? Много, ИМХО. Я 0,75мм и 1мм гели качаю в краске (без всякой предварительной фиксации) 15-20 минут, потом кипячу в дистилляте минут 10. Если хотите чистый как стекло фон, оставьте гель в холодильнике в дистилляте (небольшой обьем) на пару дней - будет супер. Крашу Кумасей G250, у R250 фон сильнее.

Olezhek
Постоянный участник
Tsukuba, Japan/КФУ, РФ

08.05.2002 14:28

URL #15

Stask, cпасибо, да, я уже осознал что много - часа вполне хватает..
А не подскажите хороший протокол для градиентного и 2D геля?
Видимо ткани у нас странные - все же эмбриончики крабов..
С in situ вообще проблемы не удалишь оболочку эмбриона - и такой ужасный фон...приходится извлекать эмбриончик из икринки и толкьо тогда упражняться..

petr
Постоянный участник

08.05.2002 16:40

URL #16

В понедельник - вторник, пришлю.

Olezhek
Постоянный участник
Tsukuba, Japan/КФУ, РФ

08.05.2002 17:41

URL #17

petr, спасибо, извините за нетерпеливость...

12.05.2002 13:55

URL #18

Olezhek, moi vam sovet: ne svyazyvaytes' vy s 2-mernymi gelyami! Zvuchit prekrasno, no na dele eto ochen' slozhnaya sistema i vam nuzhna 100% vosproizvodimost' usloviy, chtoby sravnovat' posicii pyaten. Eto delaetsya isklyuchitel'no professionalami vysokogo klassa (kto tolko etim i zanimaetsya vsyu zhizn') na firmennyh pI i SDS-gelyah (BioRad), i ne total'nom belke, a na frakciyah, t.k. neobhodimo vysokoe razreshenie - t.e. ne bolee 500 pyaten na gel'. Uzhe 500 pyaten neobhodimo nakladyvat' i analisirovat' na komp'yutere, a ne v ruchnuyu. No eto vse esli podhodit' k delu ser'ezno - otdel'nyy bolshoy proekt. Naidite luchshe s kem posotrudnichat' - mozhet v Shemyakine kto gonyaet 2D geli?

Olezhek
Постоянный участник
Tsukuba, Japan/КФУ, РФ

12.05.2002 18:27

URL #19

Gost`, da ya tozhe uzhe osoznal chto vse ne tak prosto dazhe na BioRdovskom gele....A vvobsche eto real`no usmotret` na total`nom poreze kakoi-nibud` minornii belok?
S MOSCVOI trudno - ya v Yaponii
Izvinite za translit - ya seitsas na Okinawe.
Olezhek

15.05.2002 22:24

URL #20

Dumayu, chto ne real'no. Uverena, chto ne real'no. No "popytka" posmotret' na gel' zaimet tolko odin den' - ubedites' sami. Progonite hotya by bolshoy (20cm) gradientnyy gel', nanesite proby oboih obrazcov na odin i tot zhe gel' (v etom smysle kak raz luchshe, chem 2D, gde nado sravnivat' 2 raznyh gelya, kotorye kstati vsegda raznymi poluchayutsya...)
K voprosu o subtraction: A pochemu sobstvenno vy ozhidaete tam novyy belok? Mozhet tam proishodit modifikaciya uzhe sushestvuyushego, fosforilirovanie, naprimer?

AlexeyK

18.05.2002 08:33

URL #21

Вероятнее всего, внутривидовой полиморфизм белков на уровне полипептидов у вас будет либо отсутствовать, либо вы его не поймаете на форезе, поскольку небольшие количественные отличия вообще довольно сложно поймать. Может быть, есть смысл посмотреть нативные белки - они гораздо больше различаются (во всяком случае, у разных сортов растений), чем аминокислотный состав их полипептидов. Однако это намного сложнее. Когда-то мы выкладывали на этот сайт методику нативного фореза белков - посмотрите, может она и сохранилась.

tupoi
Постоянный участник

22.05.2002 20:49

URL #22

Всем, кто работает с белковыми форезами по Laemmly, советую перед каждым использованием проверять рН буферов. Иногда они меняются даже после совсем недолгого хранения, а изменение хотя бы на 0,2 для фореза очень критично.

Поблагодарили (1): Erin

Hellynn

08.06.2002 20:53

URL #23

У меня несколько предложений.
ПОсле заливки разделяюсжего геля И наслаиваю
не воду, а смесь 50-50 водв и изопропанола. Просто
вода не даст хорошей гранитсв, а просто спирт бвстро
испаряется. А смесь можно даже забвть на несколько
часов перед заливкой контсентрируюсжего геля. При
таком наслоении у меня получается идеальная гранитса.
Что же касается окрашивания, то есть несколько правил.
Как правило раствор Цоомассие используют не по одному
разу. Поетому важно гель, перед закладкой его в краску,
как следует ввмвть водой, что бв СДС не попал в краску.
Красить полчаса на качалке достаточно. Но мне больше
нравиться кипятить. Три минутв в микроволновке или
несколько минут на горелке. Потом хорошо гель минут на
10 оставить просто в горячей краске. А уж потом можно
мвть. Либо кипятить в 10% ускусной кислоте, либо можно
есже оставлять его на качалке в растворе: 1 обьем
уксусной кислотв, 4 обьема этанола (или метанола) и 4 обьема
водв. Тот же раствор, что для краски, только без
Цоомассие. Только тут надо бвть осторожнвм и поглядввать,
что бв гель совсем не обестсветился.
Теперь про краску. Мв обвчно готовим 2 литра (готова она
будет только на следуюжий день, в свежей надо кипятить
дваждв). Берем портсию для кипячения и после егого
сливаем краску в другую емкость. Для второго окрашивания
берем уже пользованную краску. Использованную лучше
с некипяченой не смешивать. Как только в краске, после
нескольких окрашиваний появляются крупинки, эту портсию
можно ввкидввать и брать следуюсжую. Так получается
наиболее економично.
Удачи.
[Текст переведён с транслита]

Veshka
Постоянный участник
Москва

09.06.2002 00:07

URL #24

Олежеку. Что-то толковое можно увидеть ТОЛЬКО на громадных 2D гелях. Что касается дифференциального дисплея и прочих субтракций это часто есть дело пустое и дорогое. И требующее высокой квалификации в генноинженерных приложениях. Очень высокой, поверьте старому человеку

Впрочем то же часто касается и 2D. Лучше сначала подумать, что Вы вообще хотите получить, а потом кидаться в любые такие дела - от чипов до SAGE.

Mala636
Постоянный участник
Lahore, Punjab, Pakistan

30.09.2022 17:13

URL #25

Ufa1688
Постоянный участник

06.10.2022 16:26

URL #26

South Korea’s aff 1688 Joint Chiefs of Staff ทางเข้าufa1688 also said on Wednesday ufabet เข้า สู่ระบบ that the US carrier ufa1688 strike group would be ราคาบอล redeployed to the waterway, in what it สล็อตออนไลน์ characterized as a UFA1688 “very unusual” move meant “to ลิงค์รับทรัพย์ demonstrate the resolute will of the SK-US แฮนดิแคป alliance to respond decisively to any บอลสเต็บ provocation or threat from North Korea.”

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.