Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* WTA для qPCR -- преамплификация кДНК. Bias. --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Horse-radish
Участник



 прочитанное сообщение 14.04.2017 15:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Добрый день.

Необходимо образцы тотальной РНК (конечно же их мало и они очень ценны), содержащих геномку, "растянуть" на пару десятков постановок qPCR. Известная задача, для которой есть ряд решений известных вендоров с WTA китами. Подход выбрал следующий: поскольку, наряду с mRNA, нужно смотреть lncRNA, RT нужно будет ставить с рандомных праймеров. Следовательно целевую РНКу нужно чистить от геномки и rRNA (потери, потери...). Далее, используя кит для WTA, например от кайджина, лигировать и амплифицировать.

Буду признателен советам и предложениям. Ну и главный момент - линейность амплификации. У кого имеется опыт работы с WTA, применительно для количественного анализа? Какие сдвиги по Ст ожидаемы для мало и высококопийных матриц?
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 14.04.2017 15:43     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Лучшее из того, что человек придумал на эту тему:
https://www.neb.com/products/m0374-bst-3-0-dna-polymerase
https://www.neb.com/products/m0374-bst-3-0-dna-polymerase
http://www.biotechniques.com/Biotechniques...ues-353302.html
Тоже планирую с ними работать.
Работал с Ф29 - до сих пор под впечатлением. Но с тех пор много воды утекло...
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 14.04.2017 15:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

а почему вас обычная РТ-ПЦР не устраивает? вы пробовали ее?
и зачем нужна wta? изза низкой копийности матриц?

мРНК мы всегда с рандом праймерами смотрим, почему то из вашего текста вывод, что рандом праймеры нужны именно изза lncRNA. непонял почему.

у Инвитроджена щас вышла новая модификация суперскрипт SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme 50 rxn, как раз для использования в случаях когда важно чтобы с геномки не ПЦРилось.
Можно еще от ДНКазить на колонках RNeasy с ДНКазой от Qiagen.
Участник оффлайн! Horse-radish
Участник



 прочитанное сообщение 14.04.2017 16:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

(-Ъ- @ 14.04.2017 13:43)
Ссылка на исходное сообщение  Лучшее из того, что человек придумал на эту тему:
https://www.neb.com/products/m0374-bst-3-0-dna-polymerase
https://www.neb.com/products/m0374-bst-3-0-dna-polymerase
http://www.biotechniques.com/Biotechniques...ues-353302.html
Тоже планирую с ними работать.
Работал с Ф29 - до сих пор под впечатлением. Но с тех пор много воды утекло...


Спасибо, ознакомлюсь. У кайджина в "REPLI-g WTA", так понимаю, используется Ф29, поэтому кДНКу предварительно лигируют.
Участник оффлайн! Horse-radish
Участник



 прочитанное сообщение 14.04.2017 16:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

(ship @ 14.04.2017 13:45)
Ссылка на исходное сообщение  а почему вас обычная РТ-ПЦР не устраивает? вы пробовали ее?
и зачем нужна wta? изза низкой копийности матриц?

мРНК мы всегда с рандом праймерами смотрим, почему то из вашего текста вывод, что рандом праймеры нужны именно изза lncRNA. непонял почему.

у Инвитроджена щас вышла новая модификация суперскрипт SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme 50 rxn, как раз для использования в случаях когда важно чтобы с геномки не ПЦРилось.
Можно еще от ДНКазить на колонках RNeasy с ДНКазой от Qiagen.


WTA нужно для проведения прогона N-го кол-ва пцр, что невозможно выполнить с тем количеством РНК что есть.

Ваш вопрос по поводу праймирования мРНК связан с RT-qPCR или с whoe transcriptome cDNA synthesis?
Участник оффлайн! kb1
Участник



 прочитанное сообщение 14.04.2017 17:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Возможно в тему http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080...5.2015.11666788
Участник оффлайн! kb1
Участник



 прочитанное сообщение 14.04.2017 17:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

и еще http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080...6809?src=recsys
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 14.04.2017 17:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

(Horse-radish @ 14.04.2017 14:22)
Ссылка на исходное сообщение  WTA нужно для проведения прогона N-го кол-ва пцр, что невозможно выполнить с тем количеством РНК что есть.

Ваш вопрос по поводу праймирования мРНК связан с RT-qPCR или с whoe transcriptome cDNA synthesis?

И с тем и с другим. Не совсем понял формулировку выбора рандом праймеров для вашей задачи.
Звучит как будто " Взяли рандомы тк надо детектировать мРНК и lncRNA", а если бы не надо было lncNA, то взяли бы чтото другое. А взять можно либо ген-специфичные либо олиго дТ.

Минимальное количество РНК на реакцию с суперскрипт IV - 10 пикограм по мануалу, не знаю сколько у вас, но если есть хотя бы 10-100 нг РНК, то я бы обычную РТ-ПЦР попробовал. Делов на 1 день.
Участник оффлайн! Horse-radish
Участник



 прочитанное сообщение 14.04.2017 18:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(ship @ 14.04.2017 15:46)
Ссылка на исходное сообщение  И с тем и с другим. Не совсем понял формулировку выбора рандом праймеров для вашей задачи.
Звучит как будто " Взяли рандомы тк надо детектировать мРНК и lncRNA", а если бы не надо было lncNA, то взяли бы чтото другое. А взять можно либо ген-специфичные либо олиго  дТ.

Минимальное количество РНК на реакцию с суперскрипт IV - 10 пикограм по мануалу, не знаю сколько у вас, но если есть хотя бы 10-100 нг РНК, то я бы обычную РТ-ПЦР попробовал. Делов на 1 день.


Не все lncRNA с полиА хвостом. Если требуется детектировать только мРНК, по инструкции логичнее использовать олигодТ. Какая бы крутая обратная транскриптаза не была, она мне не поднимет матрицу на 2-3 порядка. Еще раз повторю, на выходе должно быть достаточно материала для нескольких десятков (сотни) постановок кПЦР.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 14.04.2017 18:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(Horse-radish @ 14.04.2017 16:16)
Ссылка на исходное сообщение  Не все lncRNA с полиА хвостом. Если требуется детектировать только мРНК, по инструкции логичнее использовать олигодТ. Какая бы крутая обратная транскриптаза не была, она мне не поднимет матрицу на 2-3 порядка. Еще раз повторю, на выходе должно быть достаточно материала для нескольких десятков (сотни) постановок кПЦР.

Ок, понял. Спасибо, если счет идет на сотни, то другое дело.
Участник оффлайн! criplenie
Участник



 прочитанное сообщение 24.04.2017 15:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(Horse-radish @ 14.04.2017 16:21)
Ссылка на исходное сообщение  Добрый день.
Следовательно целевую РНКу нужно чистить от геномки и rRNA (потери, потери...).

Для qPCR - не нужно.
Участник оффлайн! kb1
Участник



 прочитанное сообщение 24.04.2017 17:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(-Ъ- @ 14.04.2017 16:43)
Ссылка на исходное сообщение  Лучшее из того, что человек придумал на эту тему:
https://www.neb.com/products/m0374-bst-3-0-dna-polymerase
https://www.neb.com/products/m0374-bst-3-0-dna-polymerase
http://www.biotechniques.com/Biotechniques...ues-353302.html
Тоже планирую с ними работать.
Работал с Ф29 - до сих пор под впечатлением. Но с тех пор много воды утекло...


Это не WTA, а WGA, но возможно будет полезно (из новенького так сказать) http://biorxiv.org/content/early/2017/04/19/128736 и еще https://bernstein.harvard.edu/papers/2017_Chen_Science.pdf Один метод подкупает простотой, другой заявленными характеристиками

Всего благодарностей: 3Поблагодарили (3): -Ъ-, kblag, Horse-radish
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 25.04.2017 11:47     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(kb1 @ 24.04.2017 18:28)
Ссылка на исходное сообщение  Это не WTA, а WGA, но возможно будет полезно  (из новенького так сказать) http://biorxiv.org/content/early/2017/04/19/128736 и еще https://bernstein.harvard.edu/papers/2017_Chen_Science.pdf Один метод подкупает простотой, другой заявленными характеристиками

Первый метод можно испытать хоть сейчас. Только я не помню SD обладает экзо- активностями.
А если к ней домен (phusion) присобачить?

Сообщение было отредактировано -Ъ- - 25.04.2017 11:47
Участник оффлайн! R-J-Dio
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 25.04.2017 11:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

не обладает. И потом, она так накручивает, что не надо к ней ничего лепить
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  23.11.2021 15:28     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

https://replicawatches24.tumblr.com/post/64...lica-watches-uk
https://ello.co/replicawatchesuk/post/ubut9ig9g4glx-q6nyphka
https://www.evernote.com/shard/s451/client/...%2BWatches%2BUK
https://www.bloglovin.com/@rolexrelicawatch...replica-watches
https://www.designspiration.com/watcheshutuk/saves/
https://write.as/fakerolexwatches/hints-to-...lica-watches-uk
https://www.dailystrength.org/journals/hint...lica-watches-uk
https://issuu.com/replicawatchesuk/docs/dif...he_replica_watc
https://www.keepandshare.com/discuss2/5601/...lica-watches-uk
https://penzu.com/public/9e250377
https://bestreplicawatc.livejournal.com/336.html
https://www.pearltrees.com/replicawatchesuk/item349627941
https://www.intensedebate.com/people/watches24
https://anonfiles.com/N039Qf66q9/Guide_On_H...atch_Online_pdf

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 03:53
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft