Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
nigoal123 | Отправлен 05.11.2021 13:16 |
Are you ready to dive in? |
|
watchesbiz | Отправлен 04.11.2021 10:20 |
elektrikvasilij | Отправлен 08.10.2019 19:39 |
(shinavn @ 20.06.2019 06:02) Здравствуйте, Я пытаюсь оптимизировать ПЦР с праймерами, у которых комплементарный участок 20 бп и оверханг 60 ("адаптер"). Без адаптеров ПЦР работает прекрасно, нет неспецифики на геномке. Когда я пытаюсь повторить то же самое но с длинными праймерами ПЦР не идет совсемfrown.gif Праймеры остаются неизрасходованными (сингл-странд), ПЦР продукта они не образуют. Я попыталась снизить температуру отжига с 60 до 55, еффект тот же. И попробовала первые 4 цицла на 55 и оставшиеся на 72 (Тм праймера с адаптером 78), не помогло. Вторичные структуры для праймеров образуются при температурах ниже 55, и не закрывают часть комплементарную ДНК. но может кто-нибудь подскажет альтернативный вариант? повесте оверханг на втором раунде идиотам помогает скинь оверханг на второй раунд не форум а сборище киндеров если хвост длинный отреж потом оверханг дострой сплошные муки с киндерами |
|
elektrikvasilij | Отправлен 08.10.2019 19:37 |
(shinavn @ 20.06.2019 06:02) Здравствуйте, Я пытаюсь оптимизировать ПЦР с праймерами, у которых комплементарный участок 20 бп и оверханг 60 ("адаптер"). Без адаптеров ПЦР работает прекрасно, нет неспецифики на геномке. Когда я пытаюсь повторить то же самое но с длинными праймерами ПЦР не идет совсемfrown.gif Праймеры остаются неизрасходованными (сингл-странд), ПЦР продукта они не образуют. Я попыталась снизить температуру отжига с 60 до 55, еффект тот же. И попробовала первые 4 цицла на 55 и оставшиеся на 72 (Тм праймера с адаптером 78), не помогло. Вторичные структуры для праймеров образуются при температурах ниже 55, и не закрывают часть комплементарную ДНК. но может кто-нибудь подскажет альтернативный вариант? |
|
Досадная Укушетка | Отправлен 18.09.2019 20:11 |
у илюмины 60 нт стандартные оверханги мммыч не пугай киндеров сэр ваамсчето в молбиоле есть правило праймеры на сцену |
|
kenseq | Отправлен 14.07.2019 20:39 |
(ship @ 09.07.2019 13:49) шип я пцрил такие оверханги толко на микробиом 16S Illumina MiSeq |
|
ship | Отправлен 09.07.2019 12:49 |
(shinavn @ 20.06.2019 03:02) А вы можете для начала описать конечную цель того, что Вы делаете и что хотите получить? |
|
kenseq | Отправлен 09.07.2019 00:27 |
выложите ваш куев праймер | |
kenseq | Отправлен 09.07.2019 00:21 |
(shinavn @ 20.06.2019 06:02) Вторичные структуры для праймеров образуются при температурах ниже 55, и не закрывают часть комплементарную ДНК вот тут поподробней про вторичные структуры |
|
tipisev | Отправлен 21.06.2019 22:29 |
(-Ъ- @ 20.06.2019 20:37) Отжиг наоборот повышайте сколько еще позволяют 20 нт, но самое главное надо повысить ВРЕМЯ на отжиге в два-три раза (до минуты) на первых 4-5 циклах. А далее по программе 72-95 град. делайте то же количество циклов, что было с "нормальными" праймерами. Все должно быть ОК, по своему опыту. 60 оверханг Иллумина шоли наскока помню 60 бп оверханг это 16с микробиом на иллумине сделай короткий оверханг на основной пцр потом добав 3 цикла 60 бп ваамсчето делал лимон раз 60 нт оверханги Проблем небыло |
|
Посмотреть тему (откроется в новом окне) | |