molbiol.ru -> Ответ в need help with PCR

Последние 10 сообщений [ в обратном порядке ]

nigoal123	Отправлен 05.11.2021 13:16
	Are you ready to dive in? goal 123 game Check out the below list & pick any of เกม123 the article writing topics that you are 123game excited to publish.From this list of the บาคาร่า123 collection, you will definitely find interesting สล็อต123 articles that are important for nigoal123 your board exams or competitions or magazines. Some content writers may write articles within a เว็บ 123 content management nigoal system if they write them on a daily or weekly basis.
watchesbiz	Отправлен 04.11.2021 10:20
	https://app.ex.co/stories/bestreplicawatche...-regime-for-you https://rolexrelicawatches.hpage.com/replica-watches-uk.html https://www.cgmimm.com/articles/hints-to-he...lica-watches-uk https://www.deviantart.com/fakerolexwatches...es-UK-871090193 https://replicawatches24.exposure.co/best-r...eplicawatches24 https://knowyourmeme.com/users/replicawatchesuk https://www.scoop.it/topic/bestreplicawatch...ica-rolex-watch https://uberant.com/article/1268140-hints-o...ca-rolex-watch/ https://devpost.com/watcheshutuk https://www.ted.com/profiles/26540630/about https://drive.google.com/file/d/1uTx90WraSJ...iew?usp=sharing https://ibb.co/hgfZwb0 https://writer.zohopublic.com/writer/publis...10192bd4c742ceb https://replicawatches24.mystrikingly.com/b...ica-rolex-watch https://my.desktopnexus.com/ReplicawatchesU...a-rolex--31049/ https://sway.office.com/Tqm7mC7s0VWLhKAl
elektrikvasilij	Отправлен 08.10.2019 19:39
	(shinavn @ 20.06.2019 06:02) Здравствуйте, Я пытаюсь оптимизировать ПЦР с праймерами, у которых комплементарный участок 20 бп и оверханг 60 ("адаптер"). Без адаптеров ПЦР работает прекрасно, нет неспецифики на геномке. Когда я пытаюсь повторить то же самое но с длинными праймерами ПЦР не идет совсемfrown.gif Праймеры остаются неизрасходованными (сингл-странд), ПЦР продукта они не образуют. Я попыталась снизить температуру отжига с 60 до 55, еффект тот же. И попробовала первые 4 цицла на 55 и оставшиеся на 72 (Тм праймера с адаптером 78), не помогло. Вторичные структуры для праймеров образуются при температурах ниже 55, и не закрывают часть комплементарную ДНК. но может кто-нибудь подскажет альтернативный вариант? повесте оверханг на втором раунде идиотам помогает скинь оверханг на второй раунд не форум а сборище киндеров если хвост длинный отреж потом оверханг дострой сплошные муки с киндерами
elektrikvasilij	Отправлен 08.10.2019 19:37
	(shinavn @ 20.06.2019 06:02) Здравствуйте, Я пытаюсь оптимизировать ПЦР с праймерами, у которых комплементарный участок 20 бп и оверханг 60 ("адаптер"). Без адаптеров ПЦР работает прекрасно, нет неспецифики на геномке. Когда я пытаюсь повторить то же самое но с длинными праймерами ПЦР не идет совсемfrown.gif Праймеры остаются неизрасходованными (сингл-странд), ПЦР продукта они не образуют. Я попыталась снизить температуру отжига с 60 до 55, еффект тот же. И попробовала первые 4 цицла на 55 и оставшиеся на 72 (Тм праймера с адаптером 78), не помогло. Вторичные структуры для праймеров образуются при температурах ниже 55, и не закрывают часть комплементарную ДНК. но может кто-нибудь подскажет альтернативный вариант?
Досадная Укушетка	Отправлен 18.09.2019 20:11
	у илюмины 60 нт стандартные оверханги мммыч не пугай киндеров сэр ваамсчето в молбиоле есть правило праймеры на сцену
kenseq	Отправлен 14.07.2019 20:39
	(ship @ 09.07.2019 13:49) А вы можете для начала описать конечную цель того, что Вы делаете и что хотите получить? шип я пцрил такие оверханги толко на микробиом 16S Illumina MiSeq
ship	Отправлен 09.07.2019 12:49
	(shinavn @ 20.06.2019 03:02) Здравствуйте, но может кто-нибудь подскажет альтернативный вариант? А вы можете для начала описать конечную цель того, что Вы делаете и что хотите получить?
kenseq	Отправлен 09.07.2019 00:27
	выложите ваш куев праймер
kenseq	Отправлен 09.07.2019 00:21
	(shinavn @ 20.06.2019 06:02) Вторичные структуры для праймеров образуются при температурах ниже 55, и не закрывают часть комплементарную ДНК вот тут поподробней про вторичные структуры
tipisev	Отправлен 21.06.2019 22:29
	(-Ъ- @ 20.06.2019 20:37) Отжиг наоборот повышайте сколько еще позволяют 20 нт, но самое главное надо повысить ВРЕМЯ на отжиге в два-три раза (до минуты) на первых 4-5 циклах. А далее по программе 72-95 град. делайте то же количество циклов, что было с "нормальными" праймерами. Все должно быть ОК, по своему опыту. 60 оверханг Иллумина шоли наскока помню 60 бп оверханг это 16с микробиом на иллумине сделай короткий оверханг на основной пцр потом добав 3 цикла 60 бп ваамсчето делал лимон раз 60 нт оверханги Проблем небыло
Посмотреть тему (откроется в новом окне)

Иконка сообщения*	[ Без иконки ]
Введите имя
подсказка [] вст. закрывающие теги* Включить смайлики?* *	[quote=MMM,20.06.2019 06:47][snapback]1758025[/snapback] Интересно, вы сами такой изврат придумали или вам кто-то посоветовал. Не получицца!!!! Не очень понятно зачем и к чему такие "адаптеры" длинные. Альтернативы я вижу две. Первая Вы делаете несколько последовательных ПЦР с серией праймеров длиной не более 30 . Каждый раз последовательность праймеров должна смещаться все дальше по последовательности адаптера и при этом иметь в составе однонитевое продолжение последовательности. Вторая Вы делаете ПЦР с нормальными праймерами, с которыми она у вас идёт. Потом для порядку чистите полученный фрагмент электрофорезом. И далее делаете как бы один цикл с длинными адаптерами. Т. е. Денатурируете фрагмент, добавляете длинные праймеры("адаптеры") и отжигаете при низкой температуре (градусов 40 , минут 15-20) затем добавляете полимеразу и нуклеотиды и достраиваете фрагмент при 72 градусах тоже минут 5-10. Эту историю проще вообще делать не в циклере, а в простом термостате. Потом берете из этой пробирки небольшую аликвоту и с ней делаете ПЦР с короткими праймерами к концевым последовательностям "адаптеров" [/quote] размер сообщения / макс. размер: / 15360