Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
kad |
Подскажите пожалуйста кто знает - как промыть использованные капилляры для генетических анализаторов GA3130 и GA3500? Я знаю, что это делают в Синтоле, но возить их из Владивостока в Москву..... Может кто научился обходить радиометки на расходниках к GA3500? А то уже крыша едет от перевода системного времени на компьютере... Заранее благодарен за любой толковый ответ. |
XXL Постоянный участник |
|
XXL Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано XXL - 16.02.2014 20:48 |
papa Karlo Постоянный участник |
Там максимум 100-200 евро вся маета. Вы сами штук 10 наборов этих каппиляров угробите пока научитесь это делать. Зачем? Да в конце концов можно и с курьером послать ... за 500 евро. Это ничто по сравнению с обшими расходами. |
kad |
|
distemper Постоянный участник |
(XXL @ 16.02.2014 18:47) Встречный вопрос - как вы удешевляете процесс, помогает ли буфер для разведения (где заказываете набор для цикл сиквенса, поставщик предлагает за более чем 60 тыс 100 реакций)? 5x Sequencing Buffer: 400 mM TrisHCl pH 9.0 and 10 mM MgCl2 |
kad |
А заказываю реактивы всё в том же Химэксперте - все остальные у них перекупают и перепродают. Говорят в Европе бигдай дешевле в 2 раза. Нужно наладить контакты... Да и Китай под боком. Корея опять же. Сотрудник там был - для иностранцев цена секвенирования одного образца в одну сторону около 70 рублей, а своих (корейцев) ещё и дотируют - 6 рублей за образец.... Кстати думаю буфер от GA3130 закачать в емкости GA3500 и попробовать. Если пройдет, то раза в 4-5 дешевле будет. Может кто Синтоловский буфер для сиквенса пробовал?
|
XXL Постоянный участник |
|
guest: kad IP-штамп: frWKf2AKRVu2Q гость |
|
XXL Постоянный участник |
|
AlexRez Постоянный участник Екатеринбург |
|
LMP Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано LMP - 21.02.2014 14:03 |
afanasev-max Постоянный участник Irkutsk-Moscow-Irkutsk |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(afanasev-max @ 25.02.2014 12:08) 4337456 Набор реагентов для секвенирования ДНК ABI PRISM ® BigDye ® Terminator v3.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit, 1000 реакций 601 893,50 руб. Теперь я хорошо понимаю "плюшкинистов", которые умудряются ставить реакцию в 2 мкл. Ужас! |
distemper Постоянный участник |
Ну и про капилляры: у нас один умелец регенерировал и весьма неплохо. Мыл 0.1 М азоткой и потом 0.1М щелочью, или наоборот, сначала щелочью, потом кислотой-вот не помню точно ну а потом на сутки оставлял мыть миликьюшкой. у него приблуда была самодельная из старого хроматографа (точнее насос из хроматографа). Раз по 5 точно капилляры пользовали без вреда для здоровья сиквенса Сообщение было отредактировано distemper - 27.02.2014 05:18 |
-bI |
|
genseq Постоянный участник |
|
-bI |
|
avial Постоянный участник |
|
genseq Постоянный участник |
(-bI @ 03.03.2014 05:17) Уважаемый genseq, в данном случае "правильный" капилляр - очень чистый капилляр, так как в секвенаторах АБ используются капилляры из кварца без внутреннего покрытия. Отрицательно-заряженная кварцевая поверхность маскируется мономерами диметилакриламида, которые добавляются в полимеризованный ДМА (все вместе составляет POP-4, 6, 7). Это называется, кажется, "динамическое покрытие". Поэтому, смело промываем капилляр по вышеописанной схеме. Самое сложное найти подходящий переходник - пластиковую трубочку (ее как и шприц на 10 мкл лучше искать у химиков, работающих с хроматографами). Понимаю, что что-то не понимаю. Но хотелось бы понять, что именно. Исходя из чисто теоретических рассуждений мономерный диметалакриламид не имеет заряда, так что если и будет сорбироваться на кварце (в чём я тоже сильно сомневаюсь), то на электроосмос не повлияет. Наверное, какая-то добавка в ПОПы обеспечивает формирование "динамического покрытия" на голом кварце, но эта добавка является секретом фирмы. А на ДМА ссылаются для отвода глаз. |
-bI |
Например, А кварц действительно голый. |
-bI |
|
genseq Постоянный участник |
В обзоре 2000 года описано два варианта покрытия кварцевой поверхности. Чистый поливинилпирролидон устраняет электроэндоосмос, но плохо разделяет ДНК (разд. 6.4). Ещё там сказано (гл. 6.3), что полидиметилакриламид сам по себе способен сорбироваться на кварцевой поверхности и снижать электроэндоосмос. В это охотно верю. При высокой степени полимеризации толщина пристеночного слоя вполне способна устранить пристеночные осмотические эффекты. Но вот того, что в полимерный ДМА нужно добавлять его мономер, нигде не нашёл. |
-bI |
(genseq @ 03.03.2014 07:31) Извините, что вмешиваюсь не в своё дело, но "правильный" капилляр - это не тот, который очень чистый, а тот, у которого отсутствует поверхностный электроэндоосмос, вызывающий размывание зон. Так что промывка только щёлочью, удаляющая остатки "родного" защитного покрытия, качество фореза не улучшит. Нужно ещё нейтрализовать отрицательно заряженную кварцевую поверхность. Уважаемый genseq, мы с Вами вместе пришли к тому, что во-первых, остатков "родного" защитного покрытия у капилляров из кварца, используемых в АБ секвенаторах не существует. Во-вторых, отрицательно заряженная кварцевая поверхность нейтрализовывается за счет создания димнамического покрытия всякий раз, когда гель закачивается в капилляр. Таким образом, счет 2:0 в мою пользу. По-поводу мономера ДМА, кажется, это было в статьях Кристофа Хеллера 1998-99 годов. Я поищу в архиве репринты его статей и напишу результат. |
-bI |
есть полезные, на мой взгляд, советы по работе на 310 анализаторе. И люди очень отзывчивые работают в данной германской фирме. |
genseq Постоянный участник |
(-bI @ 05.03.2014 05:56) Уважаемый genseq, мы с Вами вместе пришли к тому, что во-первых, остатков "родного" защитного покрытия у капилляров из кварца, используемых в АБ секвенаторах не существует. Во-вторых, отрицательно заряженная кварцевая поверхность нейтрализовывается за счет создания димнамического покрытия всякий раз, когда гель закачивается в капилляр. Таким образом, счет 2:0 в мою пользу. По-поводу мономера ДМА, кажется, это было в статьях Кристофа Хеллера 1998-99 годов. Я поищу в архиве репринты его статей и напишу результат. Подсчётами очков не занимаюсь, но ошибки признаю. Спасибо за науку. |
akropotov |
|
Teaholic |
Подскажите пожалуйста кто знает - как промыть использованные капилляры для генетических анализаторов GA3130 и GA3500? Я знаю, что это делают в Синтоле, но возить их из Владивостока в Москву..... Может кто научился обходить радиометки на расходниках к GA3500? Эмм, поправьте меня, но насколько я помню, на капиллярах также, как и на расходниках, стоит чип, и при замене (при полностью выработанном ресурсе) прибор не даст установить старый капилляр обратно даже при смене дат. Вам не устанавливали патч на просроченную реагентику? С ним тока буфера менять приходится каждую неделю - гичего не поделаешь (часы переводить не надо) А что за патч? Расскажите подробнее, пожалуйста, если не секрет! Ну 2 мкл это зашквар, с другой стороны если читаем "коротыши" то ставим в 5 мкл с 0.5 мкл бигдая. Все живы и Щастливы Мы на практике по 0,5 мкл бигдая на 10 реакции ставим, думаю, можно и меньше. 700-800 читает нормально. Ну и не сочтите за рекламу, скайген начал торговать брайтдаем: Сами пока не пробовали, но цены бодрят. |
le lapin Постоянный участник |
|
yanchens |
|
jalex Постоянный участник |
|
vjkjrj |
Капилляры прошли 435 запусков. Используется просрочка. Полимер на приборе 6 месяцев, буферы тоже (они еще и просроченные) Готовим super Q, NaOH 0.1M, HCl 0.1M. Фильтруем через 0,2мкм. Или покупаем набор для промывки Нимаген (для 3130). Из старого мешка делаем адаптор. Я отрезал мешок, лишний пластик, и надел на цилиндрическую часть силиконовую трубку. В трубку кусок носика 1мл, на тонкий конец носика - тонкую трубку. Включаем прибор. Нагрев печки на 60С. Ручной режим (метки не считывает, двери можно не закрывать). Ставим пустые контейнеры для буферов, меняем полимер на адаптор. Ставим воду. Промывка насоса 1. инициализировать насос (закрывает клапан, поршень до упора вверх, открывает клапан) 2. поршень вниз на 10000 шагов (жидкость сливается в контейнер) повторить 4-5 раз (была проблемка, в отсутствии жидкости завис обратный клапан (видимо прилип к остаткам полимера). Пришлось сначала заполнить адаптор водой, а потом поставить его в прибор) Промывка капилляров 1. Инициализировать насос 2. заполнить капилляры 50см повторить 5-10 раз. Когда в капиллярах будет вода прибор при промывке будет перемещать поршень вниз на все 10000 шагов и прибор будет выдавать ошибку. Игнорируем. меняем Т печки на 45Сс 1. инициализировать насос 2. поршень вниз на 10000 шагов Ставим щелочь. Заполняем щелочью адаптор (пропускаем самотеком 5 мл), ставим его в прибор. Промываем насос. Промываем капилляры. Инкубируем 1 час. В это время можно несколько раз промыть капилляры. затем 1. инициализировать насос 2. поршень вниз на 10000 шагов Ставим воду. Промываем затем 1. инициализировать насос 2. поршень вниз на 10000 шагов Ставим кислоту, Промываем. Ждем 30 минут затем 1. инициализировать насос 2. поршень вниз на 10000 шагов Ставим воду. Промываем. Меняем Т на 60С 1. инициализировать насос 2. поршень вниз на 10000 шагов Ставлю кондиционирующий реагент (б/у). Промываю насос и капилляры затем 1. инициализировать насос 2. поршень вниз на 10000 шагов Ставлю полимер, буферы. 1. инициализировать насос 2. поршень вниз на 10000 шагов Визарды: пузыри. Заполнить капиляры 2 раза. запускаю секвенирование. Итог - 3 убитых капилляра (читали 200-250) восстановились (стало 600-650), в остальных стало чуть лучше чем было (читает около 650). Полимер и буферы в приборе уже 6 месяцев. Использовать методику на свой страх и риск. Сообщение было отредактировано vjkjrj - 03.12.2021 20:02 |
vjkjrj |
|
Andrey-Kr |
из патента Compositions, methods, kits and devices for molecular analysis |
Andrey-Kr |
ПДМА - экранирует капилляры, более устойчив к гидролизу, но хуже делит меченную ДНК из-за гидрофобного взаимодействия с красителями. Мочевина - денатурирует ДНК и нужна для создания нужного индекса рефракции, который важен для калибровки в многокапиллярных системах. При комнатной быстро гидролизуется из-за чего полимер "дохнет". Может быть заменена сахарами (сахарозой) для неденатурирующего фореза или диметилмочевиной для денатурирующего. Separations of DNA fragments by capillary electrophoresis in N-substituted polyacrylamides • .a~ • a Marcella Chlan ' , Sergio Rtva, Arianna Gelain ~, Antonina Vitale b, Elio Turati b Journal of Chromatography A, 781 (1997) 347-355 |
iam1688 IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE гость |
|
nigoal123 IP-штамп: frAWeMdOsBSXM гость |
You would expect the |
nigoal123 IP-штамп: frAWeMdOsBSXM гость |
Let us analyze the |
Andrey-Kr |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
guest: 123vega IP-штамп: frXqkB4MpP2jQ гость |
|
Andrey-Kr |
Скорее всего, кондиционирующий буфер - это ТЕ или Трис в небольшой концентрации. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |