Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Rob Участник |
я с вопросами по расчету ELISA. Есть стандарт, и надо по нему отпределить концентрацию образца...Образец разведен в 40 80 160 320 раз. Данные анализирую в программе Graph Prism. Не могу понять, как анализивать данные. Четыре разведения выдают одинаковую концентрацию без учета разведения... Стандарт ng/mL OD 500 2.8225 250 2.43265 125 1.7096 62.5 0.86645 31.25 0.3989 15.625 0.166 7.8125 0.08605 OD Образец 1.6365 концентрация Graph Prism 102.7582683 разведение 40 1.33515 концентрация Graph Prism 101.973191 разведение 80 0.96395 концентрация Graph Prism 101.2534448 разведение160 0.4887 концентрация Graph Prism 100.5314145 разведение320 Как из этих цифр высчитывать финальную концентрацию? Graph Prism выставлен на Asymmetric Sigmoidal, 5PL, X is log(concentration). Если кто знает, как расчтывать в экселе, буду очень признателен. Спасибо. |
vb Постоянный участник |
но, если у вас применяется для анализа метод 5PL, то в результате не может быть для каждого разведения своя концентрация. там анализируются данные по всем разведениям образца и выдается одна концентрация. что-то где-то неправильно настроили. единственно, мне кажется, X is log(concentration) нужно убрать. у вас же на входе и на выходе не логарифмированные концентрации. Сообщение было отредактировано vb - 18.08.2017 23:22 |
Rob Участник |
Может быть подскажите, как в Экселе сделать анализ на 5PL? |
vb Постоянный участник |
(Rob @ 18.08.2017 22:58) В том и загвоздка, что не выдается общая концентрация, а считается только по каждому разведению отдельная цифра.... и какую из точек брать за главную? Может быть подскажите, как в Экселе сделать анализ на 5PL? Нельзя брать какую-то точку за главную. в крайнем случае, если хотите по одному разведению, то нужно выбирать разведение в середине калибровочной кривой, между минимумом и максимумумом насыщения. Но это не 5PL, а какаянибудь регрессия будет - логистическая или линейная. Для линейной данные лучше логарифмировать, потом обратно. в экселе реализовать этот метод не так просто. Там нужно будет на бейсике вставлять процедуры (не помню, как там этот инструмент называется). Я 4PL пытался реализовать, замучался и плюнул. |
Rob Участник |
|
vb Постоянный участник |
|
Rob Участник |
Можете мне описать метод высчитывания. |
vb Постоянный участник |
(Rob @ 19.08.2017 20:08) Как я думаю, что по EC50 стандарта высчитывается концентрация образца. Можете мне описать метод высчитывания. Не совсем правильно думаете. Вы почитайте всетаки про методы анализа, начние с регрессий поостеньких. Впрочем, можно проще. вот наше сайтик для расчетов. В том числе и 5pl Myassay.com Правда не знаю, насколько можно доверять результатам. Рекомендую отвалидировать расчеты. |
Rob Участник |
Конфьюзность вопроса в том, что различные источники предлагают разные варианты расчета, переводить концентрацию в логарифмическую систему, исходя из Молярной концентрации или оставлять в mg/mL. Также разные источники прделагают линейную зависимоть расчета или синусоидную....Что есть правда и какие методы применимы для корректного анализа мне не понятно. Но все сходятся в том, что это расчеты ЕС50. И видя по тому, что в моей теме ответов, кроме Ваших, нету...то четких ответов ни у кого нету и какая из метод корректная - остается под вопросом. |
Rob Участник |
Подключайтесь к обсуждению вопроса корректного метода расчета концентрации образца по ЕС50 стандарта!!! |
MMM Постоянный участник |
Далее. Совершенно неизвестно о каком ИФА идет речь. Если это все тот же печальноизвестный сэндвич на IgG человека, в котором у вас в качестве стандарта один белок, а в качестве аналита совершенно другой белок, то приведение всех измерений к химическим эквивалентам очевидно необходимо и источники такого пересчета уходят корнями в конец 18 века начало 19века. Какая модель апроксимации лучше? На самом деле сэндвич- элиза прекрасно апроксимируется линейной регрессией и большинство производителе для сэндвич-ИФА в своих наборах рекомендуют линейную регрессию. Логистические функции апроксимации в основном используются для конкурентных схем ИФА. Можно долго обьяснять почему это так, но это не для форума. |
Rob Участник |
(MMM @ 27.08.2017 23:15) Какая модель апроксимации лучше? На самом деле сэндвич- элиза прекрасно апроксимируется линейной регрессией и большинство производителе для сэндвич-ИФА в своих наборах рекомендуют линейную регрессию. Логистические функции апроксимации в основном используются для конкурентных схем ИФА. Можно долго обьяснять почему это так, но это не для форума. На самом деле производители рекомендуют 5PL расчеты. Конкретные вопросы: Надо ли переводить концентрацию mg/mL в М? При этом молекулярная масса образцов идентична. Если переводить в М, то тогда необоходимо работать с логарифмической сигмоидальной кривой. Как определять "cut off" образца? Какие из точек титрования брать для анализа топовой концентрации образца? |
MMM Постоянный участник |
Мне вот не надо об этом рассказывать. Если на сэндвич ИФА рекомендуют 5PL модель, то лучше с такой ИФА вообще не работать. Хорошо, М образцов идентична. А образцов и стандартов идентична? Можете не переводить в М, а просто ввести поправочный коэфициент учитывающий соотношение масс образца и стандарта. - Если переводить в М, то тогда необоходимо работать с логарифмической сигмоидальной кривой. Это откуда вы такое взяли? Закон действия масс не зависит от масштабных единиц измерения количества вещества, точнее он неизменен с точность до коэфициента пропорциональности. -- Какопределять "cut off" образца? Какие из точек титрования брать для анализа топовой концентрации образца? А зачем вам определять cut off образца? И зачем вам определять топовые концентрации? И вообще, что вы под этим понимаете? Вот у меня на столе стоит тарелка супа. Какая в нем топовая коцентрация соли? Вообще там одна концентрация соли или несколько? Любая ИФА система рассчитана на определенный рабочий диапазон концентраций аналита именно в этом дипазоне и надо работать. Этот диапазон обычно указывается производителем в документации на набор. Лучше всего работать в середине рабочего диапазона, а не вблизи его границ. Сообщение было отредактировано MMM - 28.08.2017 06:28 |
vb Постоянный участник |
(Rob @ 27.08.2017 22:58) На самом деле производители рекомендуют 5PL расчеты. Конкретные вопросы: Надо ли переводить концентрацию mg/mL в М? При этом молекулярная масса образцов идентична. Если переводить в М, то тогда необоходимо работать с логарифмической сигмоидальной кривой. Как определять "cut off" образца? Какие из точек титрования брать для анализа топовой концентрации образца? Зачем переводить? Что вам это даст? одно с другим вообще никак не связано. Поправка: Необходимость логарифмирования связана с кратный изменением концентрации при титровании. Поэтому при интерполяции одни точки будут иметь больший вес , чем другие. Чтобы сблизить их веса, проводят логарифмирование по концентрации. . катофф - это термин из качественного или полуколичественного анализа. Если у вас количественный ифа, то что вы под этимподразумеваете? твою ж мать... есче раз, если вы используете 4пл, 5 пл, метод параллельных прямых, то нужно брать все точки. если вы используете интерполяцию, линейну ли, логистическую ли, нужно брать разведение, близкое к середине калибровочной кривой. Большего через интернет вы не добьетесь. Либо разбирайтесь сами, либо наймите понимающего. Сообщение было отредактировано vb - 28.08.2017 08:22 |
Rob Участник |
Относительно cut off...Есть данные, если линейная регрессия, то надо отрезать и не брать в анализ участки, котррые лежат на плато сверху и снизу...Мне очень понравилось сравненис с тарелкой супа. Я титрую этот суп на восемь точек, чтобы узнать топовую концентрацию, какие точки брать, а какие убирать? Вот Стандарт: 2.28763 1.86928 1.27768 0.78833 0.33603 0.19103 0.09518 А вот образец, концентрацию которого мне надо узнать: 2.3905 2.2335 1.95785 1.48005 0.90775 0.5636 0.2859 0.1364 Я думаю, что в образце надо два верхних разведения и одно нижнее убрать. А то, что осталось анализировать, как среднее значение, которое и даст мне топовую концентрацию. Вот под этим подразумевается cut off. Поправте меня, пожалуйста, если не правильно рассуждаю. |
MMM Постоянный участник |
(Rob @ 28.08.2017 16:15) Ответ прост те точки где градуировочная функция нелинейна. А где она линейна/нелинейна по вашим данным сказать нельзя, так как в них не указаны значения концентраций стандарта и разведений аналита. Сообщение было отредактировано MMM - 28.08.2017 17:02 |
Rob Участник |
Стандарт: 500 , 250, 125, 62.5, 31.25, 15.6....ng/mL Для образца разведение: 600, 1200, 2400, 4800, 9600, 19200, 38400, 76800. В обоих случаях, разведние с шагом 2. |
MMM Постоянный участник |
|
vb Постоянный участник |
и методом параллельных линий так как дублей нет, то статистика не очень корректно считается. Сообщение было отредактировано vb - 28.08.2017 23:19 Картинки: molbiol_Logit.jpg — (170.73к) molbiol_PL.jpg — (161.25к) |
Rob Участник |
(MMM @ 28.08.2017 20:55) Я поступил так же....И построил в экселе линейный график...Исходя из него, концентрация вышла 0,91mg/mL примерно. |
Rob Участник |
(vb @ 29.08.2017 00:18) Были дубли, но я их усреднил... Эти два расчета одного образца дают, как мне кажеться, большой разбег в концентрации между 0,7 и 0,8 млг/мл. Это норма? Благодарю...скажите, это Вы показали образец расчета? Вы могли бы со мной поделиться такими чудесными таблицами? |
Rob Участник |
Я титровал свой образец вначале с более незначительного разведения....80,160,320,640,1280,2560, 5120.. и конечно ОД стояло на месте, в районе 2,500 на верхних пяти точках....потом начало снижаться. Правильно ли я сделал, что провел дополнительное титрование к большей концентрации...или может было бы достаточно увидить скачок вниз и рачитывать концентрацию по этой точке скачка? |
vb Постоянный участник |
(Rob @ 28.08.2017 23:38) Были дубли, но я их усреднил... Эти два расчета одного образца дают, как мне кажеться, большой разбег в концентрации между 0,7 и 0,8 млг/мл. Это норма? Благодарю...скажите, это Вы показали образец расчета? Вы могли бы со мной поделиться такими чудесными таблицами? Это же разные методы. У вас при линкйной регрессии третье получилось, чего удивительного? это не образец, это расчет уже. одной поделюсь. Позже. Второй нет, это чужое. |
Rob Участник |
(Rob @ 29.08.2017 02:47) Если не возражаете, я еще один вопрос хочу задать. Я титровал свой образец вначале с более незначительного разведения....80,160,320,640,1280,2560, 5120.. и конечно ОД стояло на месте, в районе 2,500 на верхних пяти точках....потом начало снижаться. Правильно ли я сделал, что провел дополнительное титрование к большей концентрации...или может было бы достаточно увидить скачок вниз и рачитывать концентрацию по этой точке скачка? Вот ОД цифры и первое титрование, с шагом 2. 2.1367 40 2.1006 80 2.1435 160 2.14095 320 2.1595 640 1.99925 1280 1.7204 2560 1.1728 5120 После этой плитки я пошел с более сильным титрованиием: 2.3905 600 2.2335 1200 1.95785 2400 1.48005 4800 0.90775 9600 0.5636 19200 0.2859 38400 0.1364 76800 Правильно ли с делал? Простите, что задаю столько вопросов. От этого зависит моя оценка. |
vb Постоянный участник |
|
Rob Участник |
Спасибо, за таблицу в экселле. Файл/ы:
|
LK Постоянный участник Москва |
A logit regression program in Excel |
Rob Участник |
(LK @ 06.09.2017 19:29) Мы иногда пользуемся вот этой, нормально работает: A logit regression program in Excel Благодарю, попробую |
vb Постоянный участник |
(Rob @ 06.09.2017 13:09) Если Вы сможете просчитать вашей программой было бы здорово. Я хотя бы смог сверить с расчетами с Graph Prism. Спасибо, за таблицу в экселле. отправил через файлообменник. вот еще картинка до кучи.
|
Rob Участник |
(vb @ 06.09.2017 23:12) Благодарю. Концентрация на Graph Prism 5PL расчет выдается 1.514mg/mL полулогарифмический расчет в той же Graph Prism 1.782mg/mL расчет в эксель логарифмический 1.436mg/mL Ваш расчет дал 1.457mg/mL Все очень близко, как мне кажеться. Или наоборот, разбег слишком большой.? |
MMM Постоянный участник |
|
vb Постоянный участник |
у вас, кстати, оп дублей на редкость близки. |
Rob Участник |
(vb @ 07.09.2017 23:13) Обычно для ифа критерий валидности - отклонение вычисленной концентрации положительного контроля или референса не более 20%. Из этого и исходите. у вас, кстати, оп дублей на редкость близки. Извините, не понял...референс ведь идет в совсем других концентрациях...как я могу определить 20% отклонения? Какой Вы программой пользуетесь для таких красивых расчетов? Это коммерческий продукт или просто чье то творчество? |
vb Постоянный участник |
(Rob @ 07.09.2017 20:50) Извините, не понял...референс ведь идет в совсем других концентрациях...как я могу определить 20% отклонения? Какой Вы программой пользуетесь для таких красивых расчетов? Это коммерческий продукт или просто чье то творчество? Это к вашему вопросу о разнице в расчетах разными методами. До сих пор нормой доя ифа считается ошибка до 20%. Если у вас разные методы укладываются в эту ошибку, то зачем платить больше? а дальше я просто проиллюстрировал ОДИН из критериев валидности ифа. Смотрите, для стандарта у вас есть номиналтная концентрауия (та что написана производителем, или полученная вами другим, более точным методом) и есть концентрация, вычисленная по полученному в ходе аппроксимации уравнению. Причем доя нескольких разведений. так вот обычно средняя разница межлу ними для всех разведений не должна превышать 10%, а для отдельного разведения 20%., для положительного контроля еще проще - вы его вычисляете, также, как образец и сравниваете с номинальной концентрацией. Сообщение было отредактировано vb - 08.09.2017 08:03 |
vb Постоянный участник |
есть еще неплохая программа PLA. Мне она даже больше нравится, но у меня ее нет, в другой организации пользовался. Да, это все коммерческие продукты. Combistats 300 euro per year. Pla Точно не помню, но стоимость порятка 5-7 тыс евро. кстати, учтите, обычно на сайтах производителей есть демонстрационные версии или онлайн версии. Если вам два-три раза посчитать, то почему бы и не воспользоваться? Давным давно у меня был богатый опыт ифа, потом маленько отстал от жизни, другим занимался. Так случилось, что ваши вопросы на форуме совпали с моей необходимостью освежить знания и освоить последние программы и рекомендованные методы анализа . Иначе вряд ли я бы столько времени тратил . Хотя, я лучше вам помогу, чем.... Сообщение было отредактировано vb - 08.09.2017 09:13 |
Rob Участник |
(vb @ 08.09.2017 08:56) Combistats 300 euro per year. Pla Точно не помню, но стоимость порятка 5-7 тыс евро. Иначе вряд ли я бы столько времени тратил . Хотя, я лучше вам помогу, чем.... Это очень дорого, в моем случае, заполучить такие программы. Поверьте мне, благотворительность, ВСЕГДА вернется вам сторицей. И время потраченное на объяснения тут мне, начинающему практику, окупиться. |
Rob Участник |
В моих случаях, вычисляя в экселе или на Graph Prism, надо проявлять немного творчества т.к. дается концентрация каждого отдельного разведения. И надо прикидывать, что отбросить, а что взять в расчет. Что тоже вводит меня в замешательство. Благодарю, очень помогли мне |
vb Постоянный участник |
(Rob @ 08.09.2017 14:57) Вы все-таки триальные версии гляньте. Возможно, что вам сойдет. |
MMM Постоянный участник |
|
Rob Участник |
В любом случае, я попробовал....останусь тогда с тем, что есть в использовании и доступно. |
Rob Участник |
|
vb Постоянный участник |
(MMM @ 08.09.2017 16:28) Чем больше параметров в модели тем больше надо делать точек разведений. Для 5 параметрической модели надо не менее 10 точек снимать и в максимальном диапазоне. Насчет максимального диапазона согласен, насчеь мин 10 точек - нет. 5 обычно минимально достаточно, если в диапазон попали, 7 - с запасом. А откуда мнение про 10? |
MMM Постоянный участник |
Если вы возьмете любую 5 параметрическую модель(не важно алгебраический ли это многочлен или логистическая функция или рациональное алгебраическое выражение) и 5 точек вы получите линию, проходящую через все 5 точек, а вам нужно найти некое среднестатисческое решение. Минимальное количество чисел для нахождения среднего это 2. Найти середину между одним числом невозможно. Вот и получается, что бы найти некую статистическую середину нужно как минимум 10 точек для 5 параметров. А лучше больше. |
vb Постоянный участник |
|
MMM Постоянный участник |
|
nigoal123 IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE гость |
and technical language to help |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |