molbiol.ru -> Помогите разобраться с плазмидой((

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Помогите разобраться с плазмидой((

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

ViKi

Черноголовка, Московская область

23.03.2017 15:39

URL #1

Всем добрый день!
Помогите разобраться

. Суть в следующем: есть вектор pGL3-basic, провела трансформацию в штамм XL Blue. все хорошо, все растет. провела miniprep с щелочью, на форезе вроде все хорошо. провожу maxiprep на колонках (promega) появляется какой то фрагмент ниже, подскажите что это может быть? может это идти от перегруза колонки, хотя все по протоколу выполнялось? пробовала два раза, брала ночную культуру оставшуюся от miniprepa на закачку для maxi, итог тот же.
после рестрикции фрагмент не исчезает(

Картинки:
картинка: pgl3_mini.jpg

pgl3_mini.jpg — (87.12к)

Поблагодарили (1): -Ъ-

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

23.03.2017 16:30

URL #2

"Минипреп с щелочью" тоже кит от кого-то? На кит на колонках от промеги можете дать ссылку?
Если не режется - караул!
Протокол все-таки не соблюдается. Время после нейтрализации сократили до минимума, имхо, а колонке по фигу что связывать, ds или ss. Протокол хочу.

Поблагодарили (1): ViKi

ship
Постоянный участник
Moscow

23.03.2017 17:00

URL #3

не парьтесь, такое бывает, это вероятно изза колонки. это скорее всего плазмиды с никами или что-то в этом духе, с pGL3 я часто вижу дополнительные полосы. чаще чем с какими то другими плазмидами.
на клонирование это не влияет, главное вектор потом из геля чистить.

Поблагодарили (1): ViKi

Mykhaylo
Постоянный участник
Україна

23.03.2017 23:12

URL #4

Мини и макси на фото нерезаные, правильно ? Нужно было "приложить" дорожку с резаной (желательно ферментом с одним сайтом). Ибо если нерезаное, то больше похоже на то, что просто скрученость разная, что абсолютно нормально, если условия выделения разные.

Хотя в макси двоится не только нижняя полоса но и верхнняя - у вас там с белками, солями, сахарами в макси все ок? Краска форезная не двоилась при форезе?

Поблагодарили (1): ViKi

ВС
IP-штамп: frxGOYQklo76Y
гость

24.03.2017 05:08

URL #5

Однонитевое колечко?
http://bitesizebio.com/13524/how-to-identi...-plasmid-preps/

Тогда понятно, почему не режется рестриктазой.

Поблагодарили (1): ViKi

borigv
Постоянный участник
г. Саратов

24.03.2017 08:28

URL #6

Когда-то нас учили что плазмида при выделении получается в трех формах различимых на форезе: суперскурченная, никированная (однонитевой разрыв со снятием суперскручивания) и линейная (двухнетевой разрыв). Соотношение этих форм зависит от выделения.
По-моему для паники причин нет. Надо порезать минипреп и максипреп и поставить рядом - уверен что результат порадует.

P.S. а про однонитевую кольцевую молекулу понял плохо - почему она идет первой? почему так хорошо окрашена этидием?

Сообщение было отредактировано borigv - 24.03.2017 08:32

Поблагодарили (1): ViKi

ViKi

Черноголовка, Московская область

24.03.2017 10:29

URL #7

mini без кита, а во ссылка на протокол promega https://www.promega.com/-/media/files/resou...em-protocol.pdf

ViKi

Черноголовка, Московская область

24.03.2017 10:32

URL #8

я правильно поняла, что дальше для трансфекции мне нужно плазмиду из геля экстрагировать?и с ней работать уже?

ViKi

Черноголовка, Московская область

24.03.2017 10:43

URL #9

(Mykhaylo @ 24.03.2017 00:12)

вот фото mini и maxi после рестрикции. краска не двоилась никогда, а растворы все из кита были на maxi

Картинки:
картинка: pGL3_1.jpg

pGL3_1.jpg — (129.9к)

ship
Постоянный участник
Moscow

24.03.2017 11:27

URL #10

для трансфекции в клетки млекопитающих плазмиду надо чистить не из геля, а соответствующим китом или протоколом, дающим достаточно чистую днк.
а еще лучше расскажите что вы вообще делаете - и вам подскажут как решить проблему

Поблагодарили (1): ViKi

ViKi

Черноголовка, Московская область

24.03.2017 11:31

URL #11

(ship @ 24.03.2017 12:27)

вообще мы для этого и купили макси. хотим запихнуть плазмиду со встроенным регуляторным участком в клеточную линию опухолевую.

Mykhaylo
Постоянный участник
Україна

24.03.2017 11:36

URL #12

Мини отличные. Если слева макси ("остальные"), то кроме лишней полосы там вовсе непонятно что - последняя и лишняя полоса и вектор выше (соли?), в 4 вектор значительно выше при "нормальном" положении непонятно чего

Если уже хотите поморочить себе голову я бы еще выделил на ките макси чистый штамм XL Blue - мож оттуда чего вылазит. Ну или частощепящей порезать и посмотреть уйдет ли лишняя полоса вместе с плазмидой вниз.

А проще взять и выделить миди по-новому обычным щелочным лизисом за 2 часа и забыть все как старшный сон (хотя для культуралки конечно киты крайне желательны).
Может грязь какую втянули, "брала ночную культуру оставшуюся от miniprepa на закачку для maxi" когда из минипрепа отбирали для выделения и мини постояла полдня или больше в холодильнике.

sceptiguest
IP-штамп: frfgipJa8K6is
гость

24.03.2017 12:21

URL #13

Вырежьте из геля после макси неразрезаемую полоску. Отдайте ее на сиквенс инсерта со стандартным праймером Т7, чтобы убедиться что он там есть, и это - (а) не контаминация вектором без инсерта. Можете почистить и с этой плазмиды сделать ПЦР с 1 внутренним инсерт-праймером и вторым внешним, на вектор. Этот способ дешевле, но не дает 100% уверенности что с инсертом все хорошо.

(б) максипреп может по-разному цеплять всякий мусор из культуры, поскольку гомогенность происходящего на колонке поддерживать в нём намного сложнее, чем в минипрепе. как понять: вырезать и пробовать секвенировать стандартным праймером Т7 - если не получается и/или инсерта нет - в ведро. Что делать если вырезанное годно: перечистить выход максипрепа еще раз максипрепом. или сменить протокол на ионнообменную колонку с матриксом и буфером, рассчитанным на ДНК (найти хроматограф).

(в) плазмида может быть суперспирализована до такой степени, что проходит кит без раскручивания и не экспонирует свой сайт рестриктазе, по сей причине не режется, хотя вполне нормальная. как это проверить в Ваших условиях - не знаю, можно, если обе полоски дают одну плазмиду вырезать их обе, смешать и загрузить на size-exclusion-колонку в градиенте и буфере для ДНК. Они выйдут 2 пиками, как и на геле.

ship
Постоянный участник
Moscow

24.03.2017 13:45

URL #14

(ViKi @ 24.03.2017 09:31)

думаю проблема изза кита промеги. почистите плазмиду как вам выше сказали миди преп щелочным лизисом по классическому протоколу с фенол-хлороформом , пэг и прочим. и сравните с тем что чистится китом.

а еще лучше - выделите pGL3-Basic, pGL3-Control и вашу плазмиду со вставкой в параллель, проверьте по ретсрикции и форезу как на последней картнкек, и трансфецируйте в клетки. уверен, что все будет ок. убедитесь что все работает и забудьте про эти пполосу.
ну и при возможности сменить кит на нормальный (сигма, zymo, qiagen).

Поблагодарили (1): ViKi

ship
Постоянный участник
Moscow

24.03.2017 13:49

URL #15

(sceptiguest @ 24.03.2017 10:21)

или сменить протокол на ионнообменную колонку с матриксом и буфером, рассчитанным на ДНК (найти хроматограф).

вырезать их обе, смешать и загрузить на size-exclusion-колонку в градиенте и буфере для ДНК. Они выйдут 2 пиками, как и на геле.

Ну а может лучше сразу сделать ямр-спектр раствора плазмиды для выявления природы полоски в геле? или масс-спектрометрию?

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

24.03.2017 18:12

URL #16

(ViKi @ 24.03.2017 11:32)

Вы все правильно делаете и кит у Вас специальный с "борьбой с эндотоксинами" и, следовательно, никакой дополнительной очистки не требуется. Я таки думаю это проблема макси объемов - т.е. процесс обратного схлопывания плазмиды в DS-форму проходит не до конца из-за спешки наверное...

Важные этапы из протокола:
Add 12ml of Cell Lysis Solution and mix by gently inverting the tube 3–5 times. Incubate for 3 minutes at room temperature.
Note: If the Cell Lysis Solution becomes too cold, SDS precipitation may occur, which could result in poor cell lysis. If a precipitate has formed, warm the Cell Lysis Solution to 37°C with gentle shaking before use.
5. Add 12ml of Neutralization Solution to the lysed cells, cap the tube and mix by gently inverting the tube 10–15 times. It is important to completely mix the solution to ensure complete precipitation of cellular debris.
A well-mixed solution will appear fl occulant, with small- to medium-sized clumps. If the solution has not been mixed thoroughly it will instead have a coagulated appearance.

Поблагодарили (1): ViKi

Guest
IP-штамп: frfgipJa8K6is
гость

24.03.2017 19:11

URL #17

(ship @ 24.03.2017 13:49)

если плазмида пойдет в медицинские опыты её всё равно придётся не гелем характеризовать, так что можно и так.

Mykhaylo
Постоянный участник
Україна

24.03.2017 22:23

URL #18

(-Ъ- @ 24.03.2017 17:12)

Я таки думаю это проблема макси объемов - т.е. процесс обратного схлопывания плазмиды в DS-форму проходит не до конца из-за спешки наверное...

Так "фантом" же не режется, какое схлопывание? Что плазмида может идти и 10 полосами - это понятно, но резаться то она должна в одну полосу, а не в непонятно что.

Я бы все же грешил на то, что пока стоял минипреп в него что-то залетело, ну или в штамме не все чисто.

bio101

25.03.2017 18:01

URL #19

не надо по возможности пользоваться ничем Промеговским- я понимаю, что дешевле Кайджина, но.... Я бы посоветовал максипреп выделить вручную, офенолить пару раз, чтоб дети грома не боялись, и чистота такого выделения Вас удивит. Оно, конечно, проблемно, поколение П не работает вручную, да еще с фенолом

watchesbiz
Постоянный участник

23.11.2021 15:39

URL #20

https://app.ex.co/stories/bestreplicawatche...-regime-for-you
https://rolexrelicawatches.hpage.com/replica-watches-uk.html
https://www.cgmimm.com/articles/hints-to-he...lica-watches-uk
https://www.deviantart.com/fakerolexwatches...es-UK-871090193
https://replicawatches24.exposure.co/best-r...eplicawatches24
https://knowyourmeme.com/users/replicawatchesuk
https://www.scoop.it/topic/bestreplicawatch...ica-rolex-watch
https://uberant.com/article/1268140-hints-o...ca-rolex-watch/
https://devpost.com/watcheshutuk
https://www.ted.com/profiles/26540630/about
https://drive.google.com/file/d/1uTx90WraSJ...iew?usp=sharing
https://ibb.co/hgfZwb0
https://writer.zohopublic.com/writer/publis...10192bd4c742ceb
https://replicawatches24.mystrikingly.com/b...ica-rolex-watch
https://my.desktopnexus.com/ReplicawatchesU...a-rolex--31049/
https://sway.office.com/Tqm7mC7s0VWLhKAl

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.