Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
ViKi Черноголовка, Московская область |
Помогите разобраться . Суть в следующем: есть вектор pGL3-basic, провела трансформацию в штамм XL Blue. все хорошо, все растет. провела miniprep с щелочью, на форезе вроде все хорошо. провожу maxiprep на колонках (promega) появляется какой то фрагмент ниже, подскажите что это может быть? может это идти от перегруза колонки, хотя все по протоколу выполнялось? пробовала два раза, брала ночную культуру оставшуюся от miniprepa на закачку для maxi, итог тот же. после рестрикции фрагмент не исчезает( Картинки: pgl3_mini.jpg — (87.12к)
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Если не режется - караул! Протокол все-таки не соблюдается. Время после нейтрализации сократили до минимума, имхо, а колонке по фигу что связывать, ds или ss. Протокол хочу.
|
ship Постоянный участник Moscow |
на клонирование это не влияет, главное вектор потом из геля чистить.
|
Mykhaylo Постоянный участник Україна |
Хотя в макси двоится не только нижняя полоса но и верхнняя - у вас там с белками, солями, сахарами в макси все ок? Краска форезная не двоилась при форезе?
|
ВС IP-штамп: frxGOYQklo76Y гость |
Тогда понятно, почему не режется рестриктазой.
|
borigv Постоянный участник г. Саратов |
По-моему для паники причин нет. Надо порезать минипреп и максипреп и поставить рядом - уверен что результат порадует. P.S. а про однонитевую кольцевую молекулу понял плохо - почему она идет первой? почему так хорошо окрашена этидием? Сообщение было отредактировано borigv - 24.03.2017 08:32
|
ViKi Черноголовка, Московская область |
|
ViKi Черноголовка, Московская область |
|
ViKi Черноголовка, Московская область |
(Mykhaylo @ 24.03.2017 00:12) Мини и макси на фото нерезаные, правильно ? Нужно было "приложить" дорожку с резаной (желательно ферментом с одним сайтом). Ибо если нерезаное, то больше похоже на то, что просто скрученость разная, что абсолютно нормально, если условия выделения разные. Хотя в макси двоится не только нижняя полоса но и верхнняя - у вас там с белками, солями, сахарами в макси все ок? Краска форезная не двоилась при форезе? вот фото mini и maxi после рестрикции. краска не двоилась никогда, а растворы все из кита были на maxi Картинки: pGL3_1.jpg — (129.9к) |
ship Постоянный участник Moscow |
а еще лучше расскажите что вы вообще делаете - и вам подскажут как решить проблему
|
ViKi Черноголовка, Московская область |
(ship @ 24.03.2017 12:27) для трансфекции в клетки млекопитающих плазмиду надо чистить не из геля, а соответствующим китом или протоколом, дающим достаточно чистую днк. а еще лучше расскажите что вы вообще делаете - и вам подскажут как решить проблему вообще мы для этого и купили макси. хотим запихнуть плазмиду со встроенным регуляторным участком в клеточную линию опухолевую. |
Mykhaylo Постоянный участник Україна |
Если уже хотите поморочить себе голову я бы еще выделил на ките макси чистый штамм XL Blue - мож оттуда чего вылазит. Ну или частощепящей порезать и посмотреть уйдет ли лишняя полоса вместе с плазмидой вниз. А проще взять и выделить миди по-новому обычным щелочным лизисом за 2 часа и забыть все как старшный сон (хотя для культуралки конечно киты крайне желательны). Может грязь какую втянули, "брала ночную культуру оставшуюся от miniprepa на закачку для maxi" когда из минипрепа отбирали для выделения и мини постояла полдня или больше в холодильнике. |
sceptiguest IP-штамп: frfgipJa8K6is гость |
(б) максипреп может по-разному цеплять всякий мусор из культуры, поскольку гомогенность происходящего на колонке поддерживать в нём намного сложнее, чем в минипрепе. как понять: вырезать и пробовать секвенировать стандартным праймером Т7 - если не получается и/или инсерта нет - в ведро. Что делать если вырезанное годно: перечистить выход максипрепа еще раз максипрепом. или сменить протокол на ионнообменную колонку с матриксом и буфером, рассчитанным на ДНК (найти хроматограф). (в) плазмида может быть суперспирализована до такой степени, что проходит кит без раскручивания и не экспонирует свой сайт рестриктазе, по сей причине не режется, хотя вполне нормальная. как это проверить в Ваших условиях - не знаю, можно, если обе полоски дают одну плазмиду вырезать их обе, смешать и загрузить на size-exclusion-колонку в градиенте и буфере для ДНК. Они выйдут 2 пиками, как и на геле. |
ship Постоянный участник Moscow |
(ViKi @ 24.03.2017 09:31) вообще мы для этого и купили макси. хотим запихнуть плазмиду со встроенным регуляторным участком в клеточную линию опухолевую. думаю проблема изза кита промеги. почистите плазмиду как вам выше сказали миди преп щелочным лизисом по классическому протоколу с фенол-хлороформом , пэг и прочим. и сравните с тем что чистится китом. а еще лучше - выделите pGL3-Basic, pGL3-Control и вашу плазмиду со вставкой в параллель, проверьте по ретсрикции и форезу как на последней картнкек, и трансфецируйте в клетки. уверен, что все будет ок. убедитесь что все работает и забудьте про эти пполосу. ну и при возможности сменить кит на нормальный (сигма, zymo, qiagen).
|
ship Постоянный участник Moscow |
(sceptiguest @ 24.03.2017 10:21) или сменить протокол на ионнообменную колонку с матриксом и буфером, рассчитанным на ДНК (найти хроматограф). вырезать их обе, смешать и загрузить на size-exclusion-колонку в градиенте и буфере для ДНК. Они выйдут 2 пиками, как и на геле. Ну а может лучше сразу сделать ямр-спектр раствора плазмиды для выявления природы полоски в геле? или масс-спектрометрию? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(ViKi @ 24.03.2017 11:32) я правильно поняла, что дальше для трансфекции мне нужно плазмиду из геля экстрагировать?и с ней работать уже? Вы все правильно делаете и кит у Вас специальный с "борьбой с эндотоксинами" и, следовательно, никакой дополнительной очистки не требуется. Я таки думаю это проблема макси объемов - т.е. процесс обратного схлопывания плазмиды в DS-форму проходит не до конца из-за спешки наверное... Важные этапы из протокола: Add 12ml of Cell Lysis Solution and mix by gently inverting the tube 3–5 times. Incubate for 3 minutes at room temperature. Note: If the Cell Lysis Solution becomes too cold, SDS precipitation may occur, which could result in poor cell lysis. If a precipitate has formed, warm the Cell Lysis Solution to 37°C with gentle shaking before use. 5. Add 12ml of Neutralization Solution to the lysed cells, cap the tube and mix by gently inverting the tube 10–15 times. It is important to completely mix the solution to ensure complete precipitation of cellular debris. A well-mixed solution will appear fl occulant, with small- to medium-sized clumps. If the solution has not been mixed thoroughly it will instead have a coagulated appearance.
|
Guest IP-штамп: frfgipJa8K6is гость |
(ship @ 24.03.2017 13:49) Ну а может лучше сразу сделать ямр-спектр раствора плазмиды для выявления природы полоски в геле? или масс-спектрометрию? если плазмида пойдет в медицинские опыты её всё равно придётся не гелем характеризовать, так что можно и так. |
Mykhaylo Постоянный участник Україна |
(-Ъ- @ 24.03.2017 17:12) Я таки думаю это проблема макси объемов - т.е. процесс обратного схлопывания плазмиды в DS-форму проходит не до конца из-за спешки наверное... Так "фантом" же не режется, какое схлопывание? Что плазмида может идти и 10 полосами - это понятно, но резаться то она должна в одну полосу, а не в непонятно что. Я бы все же грешил на то, что пока стоял минипреп в него что-то залетело, ну или в штамме не все чисто. |
bio101 |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |