Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Total protein extraction
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! sagiM




 прочитанное сообщение 05.07.2006 15:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Уважаемые, есть ли у кого-нить протокол для выделения тотального белка из культивируемых клеток эукариот или из клеток крови.
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.07.2006 16:35     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

350мМ натрий хлор, 50мМ трис или Хепес pH-7.5, о.1% NP-40 или тритон Х-100
ингибиторы протеаз и фосфотаз я еще люблю 10% глицерина
Клетки отфуговать отмыть 2 раза PBS суспендировать в буфере ( обьем зависит от кол-ва клеток) озвучить 3-4 раза по 20 секунд - фуговать на 14000 об/мин - супер Ваш...
Guest
IP-штамп: frNQdO70Pngng
гость



 прочитанное сообщение 05.07.2006 17:58     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Хорошо бы еще полиэтиленимина добавить, для осаждения нуклеиновых кислот.
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 05.07.2006 18:15     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

"Хорошо бы еще полиэтиленимина добавить, для осаждения нуклеиновых кислот"
Имхо балоство это.... и вероятность потерь белков большая ....
После озвучки ДНК мелкая ну можно для верности ДНКазой обработать но это уже изыск....
Участник оффлайн! Danse
Участник
BELARUS, Gomel



 прочитанное сообщение 10.07.2006 16:00     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Эксперты! Можно-ли тоже самое (весь белок) из прикреплёных к пластику клеток (макрофаги) выделить без озвучивания, а то у нас из ультразвука только в соседней лабе есть ванна для мелких прибамбасов(HPLC).
А клекти так хорошо держатся и форму сохраняют и всё им мало и завораживания - оттаивания по три раза. А если детергента поболе насыпать, то потом белок сложно определить, т.к. клеток мало и концентрация белка низкая а Бредфорд (дома приготовленый) уж очень на детергенты чувствительный smile.gif
Подскажите пожалуйста как лучше поступить в такой ситуации confused.gif
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.07.2006 17:02     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

типа лисис на пластике??????
Участник оффлайн! Danse
Участник
BELARUS, Gomel



 прочитанное сообщение 10.07.2006 18:14     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Именно на пластике smile.gif бо снять их оттуда сложновато..
Причем если это ещё и будет работать после экстракции MTT смесью EtOH:DMSO тогда вообще великолепно - единый непрерывный протокол получиться wink.gif
И поясните высокая концентрация соли принципиальна? Т.К. я надеялся их (клеток) гипотонией удивить, а они удивиди меня..

Сообщение было отредактировано Danse - 10.07.2006 18:16
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.07.2006 18:21     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

ну замените тритон на 0.1-0.2 % сдс.....

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Danse
Участник оффлайн! Danse
Участник
BELARUS, Gomel



 прочитанное сообщение 10.07.2006 18:25     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(Tom1 @ 10.07.2006 18:21)
Ссылка на исходное сообщение  ну замените тритон на 0.1-0.2 % сдс.....


В этом случае должен получиться whole ceel extract? Если так то не будет ли мешать определению белка ДНК и пр.?

Определяем Бредфордом.. ибо концентрация маленькая..
Участник оффлайн! Tom1
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.07.2006 18:29     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

будет
не будет ( для вености можите ДНКазы плюнуть....
Участник оффлайн! Danse
Участник
BELARUS, Gomel



 прочитанное сообщение 10.07.2006 18:36     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Сигма предлагает жуткую смесь:

5X buffer (Tris-EDTA) 50 mL
5X DOC (Deoxycholic acid sodium salt) 50 mL
5X Igepal CA 630 50 mL
Protease inhibitor cocktail 2.5 mL P8340
5X SDS (Sodium dodecyl sulfate) 50 mL
5X sodium chloride 50 mL

А на ProtocolOnLine был такой вопросик http://www.protocol-online.org/biology-for...posts/1913.html лет пять назад и пару ответов про тритон и NP40 он же Igepal..

А соли видимо надо добавить для стабильности!

Спасибо за внимание к вопросу, бум пробовать...
yes.gif
Участник оффлайн! Danse
Участник
BELARUS, Gomel



 прочитанное сообщение 10.07.2006 19:03     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

НАШЛОСЬ!!!

Очень подробно и для всяких применений wink.gif
Cell Lysate Extracts-General Protocols от Upstate..
http://www.upstate.com/misc/protocol_detai...neral_Protocols

И цуть-цуть здесь http://www.chemicon.com/techsupp/celllysis.asp

С наилучшими пожеланиями!
Участник оффлайн! yMHuK
Участник
Орехово-Кокосово



 прочитанное сообщение 11.07.2006 02:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(Danse @ 10.07.2006 09:00)
Ссылка на исходное сообщение  Эксперты! Можно-ли тоже самое (весь белок) из прикреплёных к пластику клеток (макрофаги) выделить без озвучивания, а то у нас из ультразвука только в соседней лабе есть ванна для мелких прибамбасов(HPLC).
А клекти так хорошо держатся и форму сохраняют и всё им мало и завораживания - оттаивания по три раза. А если детергента поболе насыпать, то потом белок сложно определить, т.к. клеток мало и концентрация белка низкая а Бредфорд (дома приготовленый) уж очень на детергенты чувствительный smile.gif
Подскажите пожалуйста как лучше поступить в такой ситуации  confused.gif

Можно и на пластике. Только, чтобы всю поверхность обработать, слишком много буфера заливать придется - не самое удобное соотношение клеточной массу к объёму. Когда мне надо было лизировать большое количество жутко липучих клеток, то я их выращивал на волокниостом матриксе для биореакторов. Удобно тем, что можно разместить большую поверхность (т.е. много клеток) в небольшом объёме.
Количество и состав детергентов, равно как и сколько соли сыпануть, зависит от белка и от того, какой степени денатурированности устроит.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): CHO Master

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 12.12.19 08:53
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft