Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
metrim Постоянный участник Москва |
И вот странность: при рН 7 он не задерживаясь проскакивает через DEAE-Toyopearl , равно как и при рН 7,5, 8, 8,5, 9. Вообще не задерживается. Решил я попробовать DEAE-sephadex и на нем картина вообще обратная и дикая: при перечисленных рН зелень на колонке садится и потом независимо от рН и ионнной силы не желает смываться с колонки. Как такое может быть ?? |
sceptique Постоянный участник временной жизни |
Сообщение было отредактировано sceptique - 16.01.2018 02:15 |
sceptique Постоянный участник временной жизни |
Попробуйте весь ряд колонок, от (слабо- и сильно-) катионо- до (слабо- и сильно-)анионообменных при нативных pH, никогда нельзя предугадать что лучше чистит. Все программы моделирования какой нужен ионнообменный матрикс - тупо не работают, которые теоретически-вычислительные, на них даже время не тратят обычно. Тупо пробуйте весь диапазон матриксов что есть - и тупо выберете тот, который липнет и слезает хорошо. Может, просто белок гидрофобный попался и липнет к матрице а не к заряженным головкам. На подумать: этот белок может быть огромадным белковым комплексом, кторый больше размеров пор. А глазу это заметно не будет - стоит это засунуть в гуанидин то выделятся лишь мономеры Вашего белка. А в нативных условиях будут целые сбившиеся олигомеризованные поля... Сообщение было отредактировано sceptique - 16.01.2018 02:25
|
metrim Постоянный участник Москва |
(sceptique @ 16.01.2018 03:14) DEAE-650M , а бывают какие то еще ?
|
metrim Постоянный участник Москва |
(sceptique @ 16.01.2018 03:17) До таких изысков не дошел, попробовал только разными рН от 4,5 до 9 ну и до 1М соли. Полагал, что это должно то отодрать ...Попробуйте весь ряд колонок, от (слабо- и сильно-) катионо- до (слабо- и сильно-)анионообменных при нативных pH, никогда нельзя предугадать что лучше чистит. Все программы моделирования какой нужен ионнообменный матрикс - тупо не работают, которые теоретически-вычислительные, на них даже время не тратят обычно. Ну у меня не особо богатый выбор: тойоперл, да сефадексы, сефароз и т.д. - нет. Ну есть еще понятно целлюлоза, но затеваться с ней как то не особо смысла та ....Тупо пробуйте весь диапазон матриксов что есть - и тупо выберете тот, который липнет и слезает хорошо. Собственно экзерсисы у меня происходили в следующем порядке: вначачале белок проскочил через ДЕАЕ-тойоперл. Было предположение, что белок где-то 40-80кДа (из литературы), потому я взял в бой QAE-Sephadex A-50 , наносил на него без соли, пробовал смывать ступенчато солью, потом стал перебирать уже все подряд варианты. Зона из начала колонки никуды не двигалась, фаза понятно сжималась. Я решил, что возможно белок "залип в порах", потому сегодня приготовил DEAE-sephadex A-25 , но с ним ситуация та же , только размыв зоны получается значительней, что как бы логично, коли белок в диапазоне 40-80кДа. В этот прогон я наносил ууравновешенное 100мМ NaCl Может, просто белок гидрофобный попался и липнет к матрице а не к заряженным головкам. Ну как бы по идее то (на сколько я представляю) это наоборот: гидрофобный бы бодрее за тойопёрл цеплялся, сефадекс то погидрофильней будет. + я для пробы нанес пробу на же-10, там ни малейших задержек и сорбции. ТАк что коли б гидрофоность, то было б паде на октилсефарозе из бессолевого буфера несложно зацепить? Еще наблюдение: я концентрировал и переводил на буфер образец в центриконах, так там зелень концентрировалась внизу конуса. может ли это свидетельствовать о гидрофобности и иных свойствах ? |
ksm Постоянный участник |
|
metrim Постоянный участник Москва |
А сколько тритона полагаете разумным заправить, дабы белок таке не развалился ? |
ksm Постоянный участник |
|
vb Постоянный участник |
|
metrim Постоянный участник Москва |
Вот было дело мне акурат подобная "зеленая хрень" забила никелевую колонку, при том полностью заблокировав связывание меченного гистидином белка, вот тогда я да, намучался с отмывкой то колонки ...... Кстати, а вот у меня лежат фармациевские запечатанные (древние понятно) упаковки аффинных сорбентов, может быть удастся с кем то сменяться на Q-Sepharose ,ну или какие то современные общеупотребимые сорбенты? Не думаю, что мне когда нибудь понадобится антителами то заниматься.... |
metrim Постоянный участник Москва |
(vb @ 16.01.2018 14:18) Ну предположительно что это "водорастворимый хлорофил-белковый комплекс". Метал там понятное дело есть, но расположен как бы не на поверхности. + как анионобменник будет хелатировать катион? ну и если бы такие взаимодействия шли с ДЕАЕ, то они бы и на варианте тайпрловой матрицы происходили
|
Tom1 Постоянный участник |
У данного сорбента очень высокая остаточная гиброфобность... и места белкам просто не хватило... НМе понятно о каких порах идет речь в случае ионнообменноий хроматографии???? то что "зелень" была в нозу конуса обючное явление не только для данного белка, а для всех белков... Зелень скорее всего что-то побоное леггемоглобину т.е. белок с гемом и металлов.... то что он забил никеливую колонку не удивительно тоже самое будет если на нее нагрузить подлизированную кровь весь гемоглобин будет сидеть, а колонке все остальное в проскоке... Что бы я посоветовал.... есктрагировать в высокой соли до 1 М и пропустить через P11 фосфоцеллюлозу, хорошо помогает в случае таких "жирных" и грязных екстрактов.... а уж потом соответствен но разбавив сажать на ДЕ к примеру....
|
genseq Постоянный участник |
|
metrim Постоянный участник Москва |
(Tom1 @ 16.01.2018 17:35) то что скорее всего там есть мембраны и другая жирнота как раз говорит поведение на Тойетаперле... Мне казалось, что гидрофобный белок должен был бы наоборот залипнуть на гидрофобной матрице тойоперла, а не проскакивать через него влет. Т.е. на нем бы как раз параллельно шла и ионобменная и "млость гидрофобная" хроматография в случае гидрофобного белка. Я знаю, что были как раз случаи, что всякие меланины и т.д. на эксклюзионном тайоперле намертво залипали и промывались разве 1М щелочью.У данного сорбента очень высокая остаточная гиброфобность... НМе понятно о каких порах идет речь в случае ионнообменноий хроматографии???? Ну в случае сефадексов, маттрица на основе G-25 и G-50 со всеми вытекающими.Это в случае тайоперла и сефарозы - поры бесконечно и пренебрежимо огромные, а в случае например моно-ку - пор попросту нет и все процессы идут сугубо по заряженным группам. Что бы я посоветовал.... Я прогнал белок на ВЭЖХ на TSK2000 , получилось что то вроде 50кДа. Попробую сделать форез не грея пробу, может быть увижу зеленую полоску, прикину массу, а так же - посмотрю что еще в пробе то болтается. Удивительно, но по ВЭЖХ не сказать, что в образце как то масса других белков, получился большой пик с зеленой составляющей спектра, мусор в нулевом объеме (в том числе вероятно и с агрегатами зеленого) ну и по мелочи несколько белков поменьше
есктрагировать в высокой соли до 1 М и пропустить через P11 фосфоцеллюлозу, хорошо помогает в случае таких "жирных" и грязных екстрактов.... а уж потом соответствен но разбавив сажать на ДЕ к примеру.... |
Tom1 Постоянный участник |
======================================== если в образце полно всякой жирной дряни типа липидов, обломков мембран и т.д. они налинут, а белки с их "хилой" относительно их гидрофобностью будут в "пролете" в обеих смыслах...
|
Tom1 Постоянный участник |
====================================================== или одно из двух ... "зеленый" деийствительно мажорно выделяется в данных условиях. Его в самом деле много и от просто мажется по колонке и путает всю картинну, образуя микро агрегаты и тому подобное...
|
metrim Постоянный участник Москва |
(Tom1 @ 17.01.2018 18:03) или одно из двух ... "зеленый" деийствительно мажорно выделяется в данных условиях. Его в самом деле много и от просто мажется по колонке и путает всю картинну, образуя микро агрегаты и тому подобное... Сопоставил с калибровкой ВЭЖХ, основной пик на 22-24кДа пришелся. Поставил форез 12,5%, жирная полоса получилась где то на 19-20кДа, надо будет 15 или 20% сделать, что бы поточнее растянулось. При этом сделал я вариант с и без прогревом на 95 градусах. В обоих вариантах зеленое пятно сразу выскочило перед бромфеноловым и двигалось дальше на одном и том же расстоянии. В кипяченом полоса на 19кДа жирная, на порядок интенсивнее нескольких других полосок, находящихся в диапазоне 100+кДа (то что как раз в нулевом объеме на ВЭЖХ вылетело) и во фронте. В обоих вариантах желто-зеленая дрянь осталась обильно в лунках. В некипяченом варианте была сразу после фореза слабая зелененькая полосочка, но она даже не вошла в разделяющий гель, вероятно что то очень здоровенное. После переноса на мембрану и проявки в некипяченом варианте никаких полосок, кроме слабой во фронте - не наблюдалось. Вот такие пироги .... |
metrim Постоянный участник Москва |
|
ksm Постоянный участник |
|
metrim Постоянный участник Москва |
(ksm @ 20.01.2018 22:05) Ну если коли то в форезе он разом "отлетает"...К тому же вроде хлорофил ниже 10 вообще не заряжен, так что у меня может и не хлорофил вовсе или "не вполне обычный хлорофил", хотя по спектру - вполне даже ...... |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |