Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Так может дело в очистке DNA? HELP! -- вирусная dsDNA 191000 bp --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! rudzik




 прочитанное сообщение 14.11.2008 21:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Всем Привет! Нужен совет!
Работаю с иридовирусом комара (mosquito iridescent virus), а точнее с их ДНК (dsDNA, 191000 bp). DNA purification провожу так: начало по протоколу от кита Fermentas, т.е. add lysis solution, потом правда 1 ч при 37С, после добовляю хлороформ или фенол:хлороформ:изоамиловый спирт, потом отбираю водную фазу и добовляю 0.1 обьем 3M NaAc и 2.5 обьема спирта. После морозильника осадок растворяю в ТЕ буф.
Вопрос???: могу ли я эту ДНК "юзать" далее (ПЦР)? При форезе (0.7-1% агароза) возможная грязь уходит быстро (грязь не всегда есть), а ДНК только "выползает" с лунки! Рестрикция (Fermentas) проходит нормально (проблемы только с лямбда маркером? как готовить и разгонять?)!
PS! Самая большая проблема это ПЦР! Есть 2 пары праймеров (проверял в blast, vector) но амплификация не проходит! Не знаю в чем проблема! Может и в очистке ДНК, а может нет!
ПОМОГИТЕ!!!
Участник оффлайн! rudzik




 прочитанное сообщение 14.11.2008 21:19     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование
Вопрос
Всем Привет! Нужен совет!
Работаю с иридовирусом комара (mosquito iridescent virus), а точнее с их ДНК (dsDNA, 191000 bp). DNA purification провожу так: начало по протоколу от кита Fermentas, т.е. add lysis solution, потом правда 1 ч при 37С, после добовляю хлороформ или фенол:хлороформ:изоамиловый спирт, потом отбираю водную фазу и добовляю 0.1 обьем 3M NaAc и 2.5 обьема спирта. После морозильника осадок растворяю в ТЕ буф.
Вопрос???: могу ли я эту ДНК "юзать" далее (ПЦР)? При форезе (0.7-1% агароза) возможная грязь уходит быстро (грязь не всегда есть), а ДНК только "выползает" с лунки! Рестрикция (Fermentas) проходит нормально (проблемы только с лямбда маркером? как готовить и разгонять?)!
PS! Самая большая проблема это ПЦР! Есть 2 пары праймеров (проверял в blast, vector) но амплификация не проходит! Не знаю в чем проблема! Может и в очистке ДНК, а может нет!
ПОМОГИТЕ!!!
Участник оффлайн! Mykhaylo
Постоянный участник
Україна



 прочитанное сообщение 14.11.2008 22:05     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Можно дополнительно разок прокрутить с водонасыщеным хлороформом и переосадите спиртом.

Начальную денатурацию делаете? ДНК не "перебираете"? ДНК не в ваакууме не пересушиваете? Иногда потом бывают проблемы с ПЦР, почему - не знаю, предпочитаю досушивать на столе smile.gif

Если "может и нет" - проверяйте праймеры, играйтесь с магнием и т.д (надеюсь ПЦР смеси заведомо рабочие?)
Участник оффлайн! rudzik




 прочитанное сообщение 15.11.2008 11:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

1. начальную денатурацию делаю!
2. Не думаю! Разведение значительное!
3. С этим были проблемы, но сейчас сушу на столе!
4. Есть и мастер-микс и компоненты (tagDNApol)! И то и другое проверено - работает!
5. Шановний а як краще перевірити праймери? Можливо праймери в студію??? (for Mykhaylo)
Участник оффлайн! Kadet
Участник
Minsk



 прочитанное сообщение 15.11.2008 13:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Сомневаюсь что дело в очистке. Вероятно нужно отработать параметры амплификации. Еще раз нужно проверить праймеры.
Ъ
IP-штамп: frSMNcAkVlNuk
гость



 прочитанное сообщение 15.11.2008 14:32     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Я сомневаюсь во всем, особенно в очистке ДНК китом, не рассчитанным для выделения ДНК из комаров и мух - ставьте ПЦР с внутренним контролем с независимой матрицей и делайте выводы без гаданий.
Ъ
IP-штамп: frSMNcAkVlNuk
гость



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  15.11.2008 14:53     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

http://www.cimmyt.org/english/docs/manual/...ls/abc_amgl.pdf
Участник оффлайн! rudzik




 прочитанное сообщение 15.11.2008 15:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Нет ни мух не комаров! Есть уже чистый вирус в больших количествах! А с кита использую только лизис р-р.
Участник оффлайн! rudzik




 прочитанное сообщение 15.11.2008 15:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

спаисобо за http://www.cimmyt.org/english/docs/manual/...ls/abc_amgl.pdf
Ъ
IP-штамп: frSMNcAkVlNuk
гость



 прочитанное сообщение 15.11.2008 15:34     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(rudzik @ 15.11.2008 14:04)
Ссылка на исходное сообщение  Нет ни мух не комаров! Есть уже чистый вирус в больших количествах! А с кита использую только лизис р-р.

Понял. smile.gif Пока стввьте ПЦР с внутренним контролем, а потом что-нибудь придумаем. А среда с вирусом очень разбавленная?
Участник оффлайн! rudzik




 прочитанное сообщение 15.11.2008 18:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Вирус очищен на "подушке" (20000 об/мин) и ресуспендирован в мин. количества буфера (трис 0.05М).
Участник оффлайн! Mykhaylo
Постоянный участник
Україна



 прочитанное сообщение 15.11.2008 20:00     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Єдине що, як на мене, треба - перевірити чи вони є, чи рівні концентрації (доречі, якщо берете 100pmol на реакцію, спробуйте 10 або навіть 5) і чи відповідають за розміром . Хоча б у 3% агарозі якщо з акріламідом не зв'язуватися.
Щодо студії - "сам, любий, сам" lol.gif
Ъ
IP-штамп: frSMNcAkVlNuk
гость



 прочитанное сообщение 15.11.2008 21:01     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(rudzik @ 15.11.2008 17:42)
Ссылка на исходное сообщение  Вирус очищен на "подушке" (20000 об/мин) и ресуспендирован в мин. количества буфера (трис 0.05М).

А чем была набита "подушка"? confused.gif
Участник оффлайн! rudzik




 прочитанное сообщение 15.11.2008 21:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

30% сахароза!
Участник оффлайн! rudzik




 прочитанное сообщение 15.11.2008 21:12     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

В смислі чи є праймери, чи що? Є! Тож буду сам, наразі з колегами радився, сказали що праймери мають працювати! Дякую за пораду!
Ъ
IP-штамп: frSMNcAkVlNuk
гость



 прочитанное сообщение 15.11.2008 23:54     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

(rudzik @ 15.11.2008 20:08)
Ссылка на исходное сообщение  30% сахароза!

Из таких образцов ДНК можно и не выделять - прямо в ПЦР без выделения. Для интереса, сделайте серию разбавлений исходного концентрата. 10. 100. 1000. 10000 .... и в ПЦР. В первом цикле сделайте холд 5 мин при 95 оС.
Ъ
IP-штамп: frSMNcAkVlNuk
гость



 прочитанное сообщение 16.11.2008 00:01     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

Я русский то еле-еле, а тут по-украински frown.gif А если я заговорю на своем родном confused.gif , тогда уж точно на молбиоле НИКТО ничего не разберет. frown.gif
Я действительно ни слова по украински. weep.gif
Участник оффлайн! Mykhaylo
Постоянный участник
Україна



 прочитанное сообщение 16.11.2008 11:08     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

Ну вопрос задавался вроде по-русски, равно как и большая часть ответов, а 100 pmol и по-русски и по-украински пишутся одинаково lol.gif beer.gif
Участник оффлайн! бутанол
Постоянный участник
Новосибирск



 прочитанное сообщение 16.11.2008 15:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

а извините, вы сначала чистите вирус ультрацентрифугированием а потом выделяете или тотально?
Участник оффлайн! rudzik




 прочитанное сообщение 16.11.2008 19:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

сначала очистка, а потом выделение!
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  03.01.2022 09:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

https://wanelo.co/replicarolexwatches
https://musescore.com/fakerolexwatches
https://www.racked.com/users/Replicarolexwatches
https://sketchfab.com/Rolexrelicawatches
http://www.video-bookmark.com/bookmark/433...eplica-watches/
https://www.slideserve.com/ReplicawatchesUK...pt-presentation
https://www.theverge.com/users/Replicarolexwatches
https://www.yumpu.com/en/document/read/6532...lica-watches-uk
https://online.flippingbook.com/view/152275247/
https://www.instapaper.com/p/8767342
https://www.bigblueview.com/users/Replicarolexwatches
https://weheartit.com/watcheshutuk
https://sites.google.com/view/replicarolexwatches24/home
https://www.indiehackers.com/post/hints-on-...atch-113aef73a9
http://replicawatchesuk.esportsify.com/for...ica-rolex-watch

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 13:02
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft