Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
rudzik |
Работаю с иридовирусом комара (mosquito iridescent virus), а точнее с их ДНК (dsDNA, 191000 bp). DNA purification провожу так: начало по протоколу от кита Fermentas, т.е. add lysis solution, потом правда 1 ч при 37С, после добовляю хлороформ или фенол:хлороформ:изоамиловый спирт, потом отбираю водную фазу и добовляю 0.1 обьем 3M NaAc и 2.5 обьема спирта. После морозильника осадок растворяю в ТЕ буф. Вопрос???: могу ли я эту ДНК "юзать" далее (ПЦР)? При форезе (0.7-1% агароза) возможная грязь уходит быстро (грязь не всегда есть), а ДНК только "выползает" с лунки! Рестрикция (Fermentas) проходит нормально (проблемы только с лямбда маркером? как готовить и разгонять?)! PS! Самая большая проблема это ПЦР! Есть 2 пары праймеров (проверял в blast, vector) но амплификация не проходит! Не знаю в чем проблема! Может и в очистке ДНК, а может нет! ПОМОГИТЕ!!! |
rudzik |
Работаю с иридовирусом комара (mosquito iridescent virus), а точнее с их ДНК (dsDNA, 191000 bp). DNA purification провожу так: начало по протоколу от кита Fermentas, т.е. add lysis solution, потом правда 1 ч при 37С, после добовляю хлороформ или фенол:хлороформ:изоамиловый спирт, потом отбираю водную фазу и добовляю 0.1 обьем 3M NaAc и 2.5 обьема спирта. После морозильника осадок растворяю в ТЕ буф. Вопрос???: могу ли я эту ДНК "юзать" далее (ПЦР)? При форезе (0.7-1% агароза) возможная грязь уходит быстро (грязь не всегда есть), а ДНК только "выползает" с лунки! Рестрикция (Fermentas) проходит нормально (проблемы только с лямбда маркером? как готовить и разгонять?)! PS! Самая большая проблема это ПЦР! Есть 2 пары праймеров (проверял в blast, vector) но амплификация не проходит! Не знаю в чем проблема! Может и в очистке ДНК, а может нет! ПОМОГИТЕ!!! |
Mykhaylo Постоянный участник Україна |
Начальную денатурацию делаете? ДНК не "перебираете"? ДНК не в ваакууме не пересушиваете? Иногда потом бывают проблемы с ПЦР, почему - не знаю, предпочитаю досушивать на столе Если "может и нет" - проверяйте праймеры, играйтесь с магнием и т.д (надеюсь ПЦР смеси заведомо рабочие?) |
rudzik |
2. Не думаю! Разведение значительное! 3. С этим были проблемы, но сейчас сушу на столе! 4. Есть и мастер-микс и компоненты (tagDNApol)! И то и другое проверено - работает! 5. Шановний а як краще перевірити праймери? Можливо праймери в студію??? (for Mykhaylo) |
Kadet Участник Minsk |
|
Ъ IP-штамп: frSMNcAkVlNuk гость |
|
Ъ IP-штамп: frSMNcAkVlNuk гость |
|
rudzik |
|
rudzik |
|
Ъ IP-штамп: frSMNcAkVlNuk гость |
(rudzik @ 15.11.2008 14:04) Нет ни мух не комаров! Есть уже чистый вирус в больших количествах! А с кита использую только лизис р-р. Понял. Пока стввьте ПЦР с внутренним контролем, а потом что-нибудь придумаем. А среда с вирусом очень разбавленная? |
rudzik |
|
Mykhaylo Постоянный участник Україна |
Щодо студії - "сам, любий, сам" |
Ъ IP-штамп: frSMNcAkVlNuk гость |
(rudzik @ 15.11.2008 17:42) А чем была набита "подушка"? |
rudzik |
|
rudzik |
|
Ъ IP-штамп: frSMNcAkVlNuk гость |
(rudzik @ 15.11.2008 20:08) Из таких образцов ДНК можно и не выделять - прямо в ПЦР без выделения. Для интереса, сделайте серию разбавлений исходного концентрата. 10. 100. 1000. 10000 .... и в ПЦР. В первом цикле сделайте холд 5 мин при 95 оС. |
Ъ IP-штамп: frSMNcAkVlNuk гость |
Я действительно ни слова по украински. |
Mykhaylo Постоянный участник Україна |
|
бутанол Постоянный участник Новосибирск |
|
rudzik |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |