Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Определение концентрации белка (Брэдфорд; Лоури) -- deleted by avor --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Тема связана с: Методы Мерион Брэдфорд и Лоури
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 19.10.2007 16:16     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #51 множественное цитирование

---Как же всё-таки мерять концентрации спо Брэдфорда?

Считать кол-во аргининов и лизинов в калибровочном белке и опытном? В моём белке например аргининов всего 6.
Да, нет, надо просто калибровать по своему белку. wink.gif shuffle.gif

-- И если считать так, то его концентрация просто офигеть.
Судя по форезу, это совсем не так.
Надо учитывать их количество на мол. вес tongue.gif
Не заморачивайся обычна ошибка не достигает величины более 50% - 100% jump.gif

И кстати, какие именно остатки красит R-250?

Он не годится в Брэдфорд, а красит тоже самое. А в форезе он очень быстро достигает насыщения на градуировочной кривой.
Участник оффлайн! kletka

Киев



 прочитанное сообщение 24.10.2007 14:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #52 множественное цитирование

для Эмин. "Размытый пик" для комплекса с белком, или для чистого красителя?
Гость
IP-штамп: frQVZIqPyXv.U
гость



 прочитанное сообщение 02.11.2007 07:32     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #53 множественное цитирование

Определяла содержание белка в образцах выделенных митохондрий двумя методами - Бредфордом и Лоури. Калибровку по Брэдфорду проводила по гамма глобуллину (все реактивы Bio-Rad), а по Лоури - ВСА. результаты измерения содержания белка в одних и тех же образцах, полученные двумя методами, абсолютно не совпадают. нет никакой связи... Например, по Бр. в 1 - 16 мкг/мкл, 2 - 48, 3 - 54; а по Лоури в тех же: 1 - 22, 2- 20, 3 - 49. Видимо, дело в различии м/у двумя методами (Бр. - основные и ароматические ак, а Лоури - пептидная связь), а также в том, что для калибровки используются разные белки...
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 02.11.2007 11:18     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #54 множественное цитирование

Градуировать Брэдфорд по гамма-глобулину еще большая ошибка чем по BSA. Там офигенное занижение по сравнению с градуировкой по БСА раза в 3 в 4

--Бр. - основные и ароматические ак, а Лоури - пептидная связь

Все не совсем так Брэдфорд тоже частично реагирует с пептидной связью(иначе он не был бы красителем для шелка, а Лоури вовсю реагирует с тирозином, метионином и цистинами(цистеинами).
guest: Гость
IP-штамп: fr/51DboosOPk
гость



 прочитанное сообщение 07.11.2007 16:15     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #55 множественное цитирование

Люди добрые, помоготе. Нужно по Бредфорду определить общую концентрацию пептидов в экстракте (все пептиды до 25000 Да). Не знаю по какому белку или пептиду строить калибровку. Так, чтобы и недорого было, и эффективно. rolleyes.gif
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 07.11.2007 18:48     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #56 множественное цитирование

--Не знаю по какому белку или пептиду строить калибровку. Так, чтобы и недорого было, и эффективно.

1) По BSA/OVA и забить на все.
2) Берете ваш образец и диализуете его до победы с мембраной 10кДа против летучего буфера(низкой концентрации не более 20мМ) типа ацетат(формиат) пиридиния(аммония). Потом победно(несколько раз) лиофильно сушите во взвешенной таре. Узнаете вес сухого образца по нему колибруете Брэдфорд.
3) Все тоже самое, что и (2), но из тотального белкового экстракта вашего объекта.
Guest
IP-штамп: frv8Mvfo5WhfE
гость



 прочитанное сообщение 07.12.2007 19:35     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #57 множественное цитирование

Здравствуйте! Вопрос: кто-нибудь делал раствор по Брэдфорт с хлорной кислотой? Он вроде более устойчив, чем со спиртом и фосфорной кислотой. И еще, вроде по данной методике оптическая плотность чистого раствора должна находится в р-не 1,3-1,5, а у меня она только 0,6. Будет ли это влиять на определение белка?
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 09.12.2007 14:46     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #58 множественное цитирование

--кто-нибудь делал раствор по Брэдфорт с хлорной кислотой?
Я, нет.

--И еще, вроде по данной методике оптическая плотность чистого раствора должна находится в р-не 1,3-1,5, а у меня она только 0,6.

По какой методике и кем данной. Оптическая плотность? На какой длине волны?

А еще я люблю остатки отюзанного Брэдфорд из кюветы на фильтровашку промокать. Если такое сделать с хлорной кислотой, то можно пожар устроить.
Guest
IP-штамп: frv8Mvfo5WhfE
гость



 прочитанное сообщение 10.12.2007 09:14     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #59 множественное цитирование

--По какой методике и кем данной. Оптическая плотность? На какой длине волны?--
"Методы очистки белков" Скоупс. Длина волны - 465 нм.
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 10.12.2007 20:48     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #60 множественное цитирование

---"Методы очистки белков" Скоупс. Длина волны - 465 нм.
Угу! Ну что я могу сказать по этому поводу. Например, величина приведена для не разбавленного в 2 раза реактива. Как написано в методике при измерении холостая проба фактически разводит реакитив в два раза, возможно вы измеряли разведенную пробы, а надо было не разведенную. Весы у вас возможно врут и там не 60мг. Кювета с длинной пути 0.5см вместо 1-ого. Ну и еще в книжке может быть опечатка и длина волны не та. Так что я бы попробовал в первоисточник глянуть Analytical Biochemistry v86 p.142;v79 p.544
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 10.12.2007 21:11     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #61 множественное цитирование

еще реактивная хлорная кислота не бывает 100%, может вы ее за таковую приняли и недолили кислоты.
guest: Гость
IP-штамп: frHWt7eplAB5c
гость



 прочитанное сообщение 30.01.2008 22:52     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #62 множественное цитирование

Определяю общее содержание белка по Брэдфорду, в растворимой белковой фракции (белок, трис-HCl-буфер, MgCl2, ЭДТА) выпадает осадок. Меняла кислоту, краситель - все равно выпадает. Причем в мембраносвязанной белковой фракции меряется нормально. Подскажите пожалуйста с чем это может быть связано.
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 31.01.2008 13:27     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #63 множественное цитирование

--Подскажите пожалуйста с чем это может быть связано.
Магний дает с фосфорной кислотой малорастворимые и нерастворимые фосфаты.
Гость
IP-штамп: frc42pI/STTbM
гость



 прочитанное сообщение 20.03.2008 09:38     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #64 множественное цитирование

Здравствуйте! При попытке построить график концентрации белка для анализа по Бредфорд столнкулся с тем, что БСА (Сигмовский) при концентрациях выше 0,8 мг/мл в реактиве сворачивается. Кто-нибудь может посоветовать, на чём лучше строить график? Грубо говоря, какой белок растворим при низких рН? Определяемое вещество - иммуноглобулины, безумно дороги, строить на них график - нереально.
Guest
IP-штамп: frtqj.kwixseM
гость



 прочитанное сообщение 20.03.2008 12:08     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #65 множественное цитирование

да не работайте при концентрациях выше 0.5 мг/мл, разбавляйте растворы!
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 20.03.2008 14:24     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #66 множественное цитирование

0,8 мг/мл - это конечная в Брэдфорде. Тогда ничего удивительного у меня уже при 30-50мкг/мл начинается зашкал и нелинейность. Если же просто капнуть несколько мкл БСА с концентрацией 1мг/мл ничего в осадок не выпадает (Ну вообще то выпадает часика через 3-4) у меня БСА сигмовский V-ая фракция.

Похоже у вас фиговое качество кумаси.

Далее: Иг дают на брэдфорде заниженный результат, если его калибровать по БСА раза в 1.5-2.

Так что вам по любому БСА неподходит. Купите препарат общий(неспецефичный) имуноглобулинов того же зверя, что и ваши супер пупер антитела. Он сравнительно недорогой более того грубую фракцию ИгG легко самим просто выделить высаливанием сульфатом аммония из сыворотки крови.

Да, и считатется, что 1мг/мл ИгG на 1см на длине волны 280нм дает экстинцию порядка 1.35-1.45.
Участник оффлайн! А
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 24.03.2008 20:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #67 множественное цитирование

И что взять вместо БСА, если Ig не интересуют?
Участник оффлайн! А
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 24.03.2008 20:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #68 множественное цитирование

(Эмин @ 20.10.2007 14:52)
Градуируйтесь по своему белку.

И как это сделать, если коммерческих препаратов не существует, а до гомогенности еще не почистили?
Участник оффлайн! А
Постоянный участник
Россия



 прочитанное сообщение 24.03.2008 20:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #69 множественное цитирование

Кстати, а ЧСА как?
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 25.03.2008 17:35     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #70 множественное цитирование

--И что взять вместо БСА, если Ig не интересуют?

БСА и взять, хотите подороже возмите OVA.

--И как это сделать, если коммерческих препаратов не существует, а до гомогенности еще не почистили?

Никак. Что вы в таком случае измерять собираетесь. Смесь белков у каждого своя сорбция краски, для градуировки годится любой стандарт с известной концентрацией тотального белка. Естественно абсолютную концентрацию вы в любом случае будете измерять с некоторой не катастрофичной ошибкой. Зато относительную более менее корректно.

--Кстати, а ЧСА как?

Никак, так же как БСА.
Гость
IP-штамп: frStLqL5.YgBU
гость



 прочитанное сообщение 25.04.2008 16:21     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #71 множественное цитирование

Здравствуйте!
Такой вопрос.
Приготовили раствор кумасси G-250 для Брэдфорд (все строго по прописи: 100 мг кумасси да в 50 мл 95% спирта да в 100 мл 85% фосфорной и водой до 1 л), а он, зараза, не такой получчается, каким мы его хотим видеть. Ночь стоял, но даже после этого после фильтрации не то чтобы коричневым получился, а каким-то болтно-зеленым. Пробовали строить по нему калибровку по БСА, а там показатели что для 0.8 мг-1.4, что для 70 мкг-1.22. Калибровка в итоге префиговая.
Есть подозрения по поводу фосфорной кислоты, что она вовсе не 85%, а чуть ниже. Хотелось бы узнать ее плотность при 20-25 С и проверить концентрацию, а справочника под рукой нет (и денсиметра нужного тоже). Подскажите пожалуйста цифрки! Заранее пасиб!
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 25.04.2008 17:54     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #72 множественное цитирование

--Есть подозрения по поводу фосфорной кислоты, что она вовсе не 85%, а чуть ниже.

Абсолютно правильные предположения.

-- Подскажите пожалуйста цифрки! Заранее пасиб!

1.684-85%
1.630-80%
1.655-82.5%
Гость
IP-штамп: frhK3pgc32wP.
гость



 прочитанное сообщение 27.08.2008 19:20     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #73 множественное цитирование

Здравствуйте! Подскажите, пожалуйста, можно ли откалибровать "Бредфорда" по пероксидазе для определения ее же самой, притом, что она экстрагирована натрий-фосфатным буфером РН=6? Или надо покупать препарат?
И еще: Что такое БСА? Это покупается или готовится?
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 27.08.2008 19:50     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #74 множественное цитирование

--Подскажите, пожалуйста, можно ли откалибровать "Бредфорда" по пероксидазе для определения ее же самой,
Можно.
--притом, что она экстрагирована натрий-фосфатным буфером РН=6?
Это нормально буфер подходящий, только вам должна быть известна ее концентрация, определенная независимым методом типа(что там 430/280) или какой то другой способом. Собственно пероксидаза мерятся по собственной окраске, зачем ей Брэдфорд непонятно.
--И еще: Что такое БСА? Это покупается или готовится?
Бычий Сывороточный Альбумин.
Купить сухой проще. Сделать самому раствор.
Гость
IP-штамп: frhK3pgc32wP.
гость



 прочитанное сообщение 28.08.2008 17:46     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #75 множественное цитирование

Спасибо большое Вам ммм!А нужно это для того, чтобы в формулу пересчета активности фермента подсавлять уже количество белка, определенного по Брэдфорду, а не показания оптической плотности окрашенного ОФД. Умные люди говорят, что так, мол, точнее результат
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 28.08.2008 18:56     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #76 множественное цитирование

Еще раз повторяю, что для калибровки вам нужен образец с заранее известной концентрацие пероксидазы. Даже если у вас есть лиофилизированный порошок и вы его собрались взвешивать его надо подсуить прерд взвешиванием в вакууме при температуре 50-60 градусов(возможно это убет ее, как фермент но сохранит окраску в брэдфорде.

По Сигме(Delincee, H. and Radola, B.J., Eur. J. Biochemistry, 52, 321–330, 1975.) 1мМ(44мг/мл) пероксидазы на 403 нм дает поглощение 100 единиц/см

Возможно вам не нужен Брэдфорд, а для определния количества пероксидазы просто измерять поглощение на 403нм. Ну и еще учитыват поглощение на 275нм.
Участник оффлайн! michael1987
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.11.2008 22:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #77 множественное цитирование

______

Давайте без обяснений механизмов, а только эмпирику. Кислота способствует образованию коричневой формы красителя, чем ее больше тем тяжелее белку связать краситель в синий цвет. Если кислоты мало то исходный краситель имеет сильную синезеленую опалесценцию. А градуировчная кривая очень крутая с коротким линейным отрезком и быстро выходит на плато. Если кислоты много то раствор сильно коричневый и не имеет осинезеленой опалесценции, а градуировачная кривая пологая и сохраняет линейность до довольно высокой концентрации белка, но зато снижается ее чувствительность вплоть до полного отсутствия.
Известно что фосфорная кислота склонна всасывать в себя воду, кроме того фосфорная кислота может иметь разную концентрацию и в товарном виде, пропись же раствора Брэдфорд написана для 85% кислоты, если в исходном растворе концентрация кислоты отличается от это цифры, возможны траблы.
_____

Дополнения к данной теме. Эмпирика процесса как раз очень интересная. Я 2 дня промучился с получением раствора Бредфорд правильной. Теперь, зная немного процесс могу дать совет правильного приготовления раствора в 99% случаев :). Для начала Кумаси Р и Г по химизму сходны. Р отличается от Г только двумя метилированными остатками, отсюда его чувствительность по связыванию с белками ниже на порядок. Много препаратов Кумаси есть "грязными" по природе :), кроме того Кумаси сам плохо растворяется. Поэтому при растворении в кислоте о дает коричневый цвет за счет образования коллоидных частиц в кислой среде. При доведении смеси дистиллятом до нужного соотношения скорее всего коричневого цвета вы никогда не получите. Я не получил еще :). В лучшем случае капая понемногу можно получить сине-зеленоватый цвет, что отображает изменения коллоидного раствора. В большинстве случаев цвет будет грязно-синий или синий, и это мало чем зависит от "белков вокруг вас" (я вот когда готовил по локти был в этаноле) :). Правда это не совсем так, и я советую все вымывать спиртом для чистоты реактива. Но под конец синий оттенок в большинстве случае стерильного приготовления реактива обуславливается наличием взвеси частиц нерастворившиегося Кумаси. Перед доливанием дистилята раствор концентрирован, по мере разбавления коричневый цвет становится слабее и синева становится все заметнее, между коричневым и синим возникает ряд переходящих оттенков, включая зеленый, салатовый и др. (она была и в начале, просто не заметна при коричневой окраске). Полученный синий реактив легко превращается в коричневый при удалении не растворившегося реактива путем фильтрования (подойдет любой чистый кусок ватмана). После фильтрования вы получаете чистейший и прозрачнейший раствор коричневого цвета. ВОт он уже будет синеть при наличии белков очень заметно. При приготовлении и встряхивания раствора должна появляться легкая пеннистость. Это значит, что как минимум посуду вы познакомили со спиртом, так как не следует забывать, что смеси воды со спиртом (даже маленькой концентрации) уменьшают поверхностное натяжение и способствуют образования пенистой структуры воды. Реактивы лучше готовить в стеклянной посуде, так как с пластиком Кумаси прочно связывается и очень тяжело вымывается. Для экономии этилена, предварительно можно промыть посуду и кюветы пропиловым спиртом или другим, менее дефицитным. После каждого измерения обязательно промыть спиртом кювету, особенно это касается пластиковым кювет - без этого линейности калибровки вы никогда не получите. Вот в принципе и все. Если повторять все вышеописанное, реактив всегда будет одинаковый как и результаты. Удачи!
Участник оффлайн! michael1987
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.11.2008 22:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #78 множественное цитирование

_____

Еще раз повторяю, что для калибровки вам нужен образец с заранее известной концентрацие пероксидазы. Даже если у вас есть лиофилизированный порошок и вы его собрались взвешивать его надо подсуить прерд взвешиванием в вакууме при температуре 50-60 градусов(возможно это убет ее, как фермент но сохранит окраску в брэдфорде.
____

Мы практиковали еще просушку белка для калибровки в роторном испарителе :) (навеску вдвое большую, чем надобно, помещали в фольгу и плотно заматывали, примеси туда при сушке почти не попадают, а водяная пара хорошо оттягивается через микрощели в фольге). Довольно неплохо получается. Легкий вакуум, 30 градусов, 40 минут - красота.
Участник оффлайн! michael1987
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.11.2008 22:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #79 множественное цитирование

_____
Известно что фосфорная кислота склонна всасывать в себя воду, кроме того фосфорная кислота может иметь разную концентрацию и в товарном виде, пропись же раствора Брэдфорд написана для 85% кислоты, если в исходном растворе концентрация кислоты отличается от это цифры, возможны траблы.
_______

Кстати, необязательно использовать именно 85% кислоту. Нужно пересчитать, какая в конечном растворе концентрация кислоты и исходить из этого. Правда это проверено для кислот с концентрацией 85 и более процентов. Я готовил из 95% кислоты. Если процент кислоты больше 85, то ее нужно брать меньше, а недостающий объем заменять водой, то есть, разводить прямо в реактиве. При кислоте меньше 85%, нужно брать больше килоты и меньше воды. Главное чтобы процент кислоты в конечном растворе не изменялся.
Гость
IP-штамп: frlbfbSqS0Xpc
гость



 прочитанное сообщение 06.12.2008 15:47     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #80 множественное цитирование

я так полагаю, что для определения общего белка в сыворотке крови мне ни один из этих методов не подойдет, т.к. калибровка по БСА неадекватна. Как же померить общий белок и изменения его количества?
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 11.12.2008 21:19     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #81 множественное цитирование

--я так полагаю, что для определения общего белка в сыворотке крови мне ни один из этих методов не подойдет, т.к. калибровка по БСА неадекватна. Как же померить общий белок и изменения его количества?

Нет, эту проблему можно обойти. Внеся попавочный коэфициент. Кроме того чуть ли не 90% сывороточного белка - альбумин ошибка любого метода такова, что на его фоне определить колебания концентрации других белков нетривиальная задача. А раз там албуми основной белок, то калибровка по альбумину будет одной из самых адекватных. Так что я вообще не понимаю смысл мерить колебания общего белка в сыворотке.
Гость
IP-штамп: fr6a7wMX9KZzQ
гость



 прочитанное сообщение 05.02.2009 22:45     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #82 множественное цитирование

помогите - какой процент белка в клетках молонокислых микроорганизмов?
Участник оффлайн! Крыска
Участник



 прочитанное сообщение 19.02.2009 14:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #83 множественное цитирование

Процент белка никто никогда не считает, хотя бы потому что основную часть веса/объема составляет вода, а ее количество варьирует достаточно сильно. Считают сухой вес, а белок составляет примерно 50% этого самого сухого веса.
Участник оффлайн! studenttka




 прочитанное сообщение 28.02.2010 12:50     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #84 множественное цитирование

Здравствуйте всем! Напишите, пожалуйста, кто обсчитывал блоты и форезы (белковые) с целью количественного определения и распределения белка в дорожке и в полосе. Я пытаюсь это сделать с помощью LabImage 1D Kapelan, но в доступной демо версии нельзя (или я не могу?) проанализировать свои гели и блоты, так как их нельзя загрузить...Не знаю, что делать. Помогите, пожалуйста!!!!
Участник оффлайн! Эмин




 прочитанное сообщение 28.02.2010 13:33     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #85 множественное цитирование

Попробуйте ImageJ. Это простая программа и разобраться в ней не сложно.
http://rsbweb.nih.gov/ij/
Участник оффлайн! wwwmol




 прочитанное сообщение 01.03.2010 12:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #86 множественное цитирование

А вот все так уверено говорят про окраску петидной связи. А что это собственно значит?
guest: studenttka
IP-штамп: frGqyYT8IU7LU
гость



 прочитанное сообщение 10.03.2010 15:28     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #87 множественное цитирование

To Эмин: Спасибо. Я воспользовалась OptiQuant - просто и быстро:)
Участник оффлайн! ksm
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.03.2010 15:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #88 множественное цитирование

пептидная связь - C-N - между аминокислотами в белке. т.е. истинно колличественными являются методы в которых окрашивается именно она
Участник оффлайн! katsu




 прочитанное сообщение 14.10.2010 23:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #89 множественное цитирование

Люди! Человеки! Что вы мучаетесь? Мы в нашей лабе успешно определяем белок по прямому поглощению пептидной связи: 200-215 нм (выбирайте любую длину волны).

Преимущества:
1.никаких красителей и грязи,
2.белок нативен,
3.чувствительность в 0,01-0,1 мг/мл (в 10 р больше Бредфорд)
4."видит" хоть двух аминокислотные пептиды
5."видит" пептиды и белки с любым аминокислотным составом (а не как Бредфорд, который например не видит глутатион, потому что в нем нет лизина)

Сама лично определяла в пробах методом Бредфорд и спектрофотометрическим при 205 нм: числа идут абсолютно параллельно, только при 205 они выше, так как Бредфорд не "видит" много белков и пептидов

Могу дать ссылки если надо
gest
IP-штамп: fr.ReEIhc9B8A
гость



 прочитанное сообщение 15.10.2010 05:53     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #90 множественное цитирование

(katsu @ 14.10.2010 23:50)
Ссылка на исходное сообщение  Люди! Человеки! Что вы мучаетесь? Мы в нашей лабе успешно определяем белок по прямому поглощению пептидной связи: 200-215 нм (выбирайте любую длину волны).

Преимущества:
1.никаких красителей и грязи,
2.белок нативен,
3.чувствительность в 0,01-0,1 мг/мл (в 10 р больше Бредфорд)
4."видит" хоть двух аминокислотные пептиды
5."видит" пептиды и белки с любым аминокислотным составом (а не как Бредфорд, который например не видит глутатион, потому что в нем нет лизина)

Сама лично определяла в пробах методом Бредфорд и спектрофотометрическим при 205 нм: числа идут абсолютно параллельно, только при 205 они выше, так как Бредфорд не "видит" много белков и пептидов

Могу дать ссылки если надо


Жесть!!! Так можно мерить только в относительно чистых р-рах белка. Знаете, в аналитике есть такая хреновина, называется влияние матрицы? Так вот на 215, а особенно на 200 будет поглощать фигова туча соединений, многие из которых будут это делать сильнее, чем белок.
Участник оффлайн! katsu




 прочитанное сообщение 15.10.2010 17:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #91 множественное цитирование

Я вам говорю, я уже два года измеряю гомогенаты рыб после ультрацентрифугирования, и не просто так, а двумя методами одновременно (я сама очень недоверчива). Получается одна и таже динамика (то есть при введении коэффициента пересчета вы получите абсолютно теже числа, что и Бредфордом).

Это значит, что если что-то и поглощает в этом диапазоне (кстати, что?), то это уровень этого вещества в тканях столь же константен как и сам белок, а значит, даже с этим допущением эти цифры можно использовать для определения скажем относительной активности фермента в пересчете на белок.
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 15.10.2010 19:45     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #92 множественное цитирование

--кстати, что

Практически все, карбонаты, фосфаты, мочевина, ацетаты, бораты, трис, ацетон, аминокислоты, мочевина, формалин и тд
Guest
IP-штамп: fr0elurLgcEUY
гость



 прочитанное сообщение 16.10.2010 09:15     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #93 множественное цитирование

(katsu @ 15.10.2010 17:39)
Ссылка на исходное сообщение  Я вам говорю, я уже два года измеряю гомогенаты рыб после ультрацентрифугирования, и не просто так, а двумя методами одновременно (я сама очень недоверчива). Получается одна и таже динамика (то есть при введении коэффициента пересчета вы получите абсолютно теже числа, что и Бредфордом).


Сочувствую. Вы уже два года измеряете в гомогенатах концентрацию хрен-знает-чего на 200-215 нм, наивно полагая, что измеряете концентрацию белка, да еще и двумя методами. Какими, кстати? И в гомогенатах чего? Надеюсь не икры?

(katsu @ 15.10.2010 17:39)
Ссылка на исходное сообщение Это значит, что если что-то и поглощает в этом диапазоне (кстати, что?), то это уровень этого вещества в тканях столь же константен как и сам белок, а значит, даже с этим допущением эти цифры можно использовать для определения скажем относительной активности фермента в пересчете на белок.

Как Вам уже сказали, очень много всего. Кстати, Ваш вопрос ("кстати, что?) очень красноречив. Без обид. Вы плохо представляете себе физическую сущность аналитических методов, которыми пользуетесь.

Вообще, мое ИМХО, измерение активности фермента в пересчете на белок в биосубстратах - это часто бессмысленная, но прочно устоявшаяся в биологии процедура. Мое предположение, что она перетекла в биологию из биохимии, где принято мерить удельную активность фермента в процессе очистки. Ну, в самом деле. Вы, к примеру, меряете активность фермента в гомогенате из хрен-знает-чего. В этом гомогенате, фермент составляет жалкую долю процента от всего белка. Поэтому можно просто тупо мерить активность в пересчете на вес того, что вы берете для гомогенизации. Главное, все делать единообразно.
Участник оффлайн! katsu




 прочитанное сообщение 22.10.2010 22:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #94 множественное цитирование

в гомогенатах жабр, печени, почек и мышц плотвы, щуки и сига
Участник оффлайн! katsu




 прочитанное сообщение 22.10.2010 22:40     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #95 множественное цитирование

нет, на сырой вес пересчитывать нельзя, потому что содержание воды может сильно кол***ся в навеске. Можно пересчитывать на сухой вес, но трудно. Можно на ДНК - еще труднее.
А пересчитывать на что-то надо, ибо каждая индивидуальная навеска нет-нет да и отличается по разбавлению и проч. в силу чисто технических причин.

Я спрашиваю "кстати что?", потому что другие крупные биоорганические молекулы в этом диапазоне не поглощают. А остальные очевидно находятся в клетке на постоянном уровне, что и подтверждают мои данные о строгой параллельности данных полученных Бредфорд и по оптическому поглощению.
Guest
IP-штамп: fraS2pF4sBl5I
гость



 прочитанное сообщение 26.10.2010 13:35     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #96 множественное цитирование

(katsu @ 22.10.2010 22:40)
Ссылка на исходное сообщение  
Я спрашиваю "кстати что?", потому что другие крупные биоорганические молекулы в этом диапазоне не поглощают.


Поглощают-поглощают, еще как. А еще очень много мелких молекул - гораздо сильнее (есть такая хрень - молярная экстинкция, а еще - закон Бугера-Ламберта-Бера).
Участник оффлайн! katsu




 прочитанное сообщение 01.11.2010 15:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #97 множественное цитирование

Я что-то не понимаю, а почему нет претензий к методу определения белка по спектрофотометрическому поглощения при 260-280 нм, где уж точно поглощают нуклеиновые кислоты и проч, и только некоторые аминокислоты, и который активно используется в УФ-детекторах при хроматографии?

А наш метод (довольно давно, кстати известный) более точен и с теоретической точки зрения и как я утверждаю с практической!
guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость



 прочитанное сообщение 01.11.2010 17:18     Сообщение для модератора       
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #98 множественное цитирование

--Я что-то не понимаю, а почему нет претензий к методу определения белка по спектрофотометрическому поглощения при 260-280 нм, где уж точно поглощают нуклеиновые кислоты и проч, и только некоторые аминокислоты, и который активно используется в УФ-детекторах при хроматографии?

ЭЭЭ Нуклеиновые кислоты и на 200 поглощают. А претензий к методу на 280 не меньше чем к методу на 200. Им пользуются для чистых белков в основном. Для смесей так белок никто не измеряет. В УФ детекторах он используется потому что вы смотрите пики и все при чем в этих пиках может быть дикая смесь. После это фракции еще раз анализируют скажем форезом, Western'ом или другим более разрешающим методом. те в данном случае поглощение на 280 промежуточный ориентировочный результат.
Участник онлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 01.11.2010 17:42     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #99 множественное цитирование

(katsu @ 01.11.2010 16:08)
Ссылка на исходное сообщение  Я что-то не понимаю, а почему нет претензий к методу определения белка по спектрофотометрическому поглощения при 260-280 нм, где уж точно поглощают нуклеиновые кислоты и проч, и только некоторые аминокислоты, и который активно используется в УФ-детекторах при хроматографии?

А наш метод (довольно давно, кстати известный) более точен и с теоретической точки зрения и как я утверждаю с практической!

Классы прошла межет быть все, а коридор точно нет... frown.gif
"Ваш метод" гениально прост. lol.gif
Участник оффлайн! amiel




 прочитанное сообщение 21.01.2011 02:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail

по Брэдфорду.
1. Комплекс красителя с белком светочувствительный.
2. увеличение чувствительности возможно при уменьшении объема, но здесь возникает куча нюансов.
3. Многие белки плохо поглощают на 280 нм, микрограммы не обнаружить

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 17.10.19 15:47
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft