molbiol.ru -> Как экспрессировать белок в колях

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Как экспрессировать белок в колях -- с цинковым пальцем? --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

J
Постоянный участник
Цитадель Рос

14.08.2005 13:01

URL #1

вот уже во второй раз заметил, что белки с цинковым пальцев не хотят просто экспрессироваться в колях, а если палец удалить - охотно это делают.
Какие такие условия нужны чтобы эеспрессия удавалась, помимо добавления
хлорида цинка?

yack
moderator
Москва, Россия

15.08.2005 08:44

URL #2

Вообще-то они экпрессируются. Другое дело, что они токсичны.
Хлорид цинка, действительно, помогает.
Идеальная ситуация, если фингер можно загнать в тельца включения, так как сворачивается он довольно охотно.
В противном случает требуется применять стандартные протоколы по работе с токсичными белками (28С при работе с неиндуцированной культурой, использование репрессоров типа pLysS/E, глюкозы, мониторинг индукции на холоду). Сильно помогают игры с конструкцией (какой фрагмент белка взять, сколько и чего оставить вокруг фингера).

Поблагодарили (1): J

J
Постоянный участник
Цитадель Рос

15.08.2005 10:38

URL #3

удивительно, что огромный белок без маленького пальца экспрессируется отлично, а сним - нет. Причем палец не является ДНК-связывающим, не знаю, почему он токсичен?

J
Постоянный участник
Цитадель Рос

15.08.2005 10:40

URL #4

пробовал 18 градусов, белок был нужен полноразмерный, я не в пальце заинтересован, а в белке в целом, поэтому разные там делетанты отпадают, полноразмерным вот и интересуюсь

yack
moderator
Москва, Россия

15.08.2005 13:23

URL #5

А он случайно не близко к N-концу?

J
Постоянный участник
Цитадель Рос

15.08.2005 14:38

URL #6

нет, все на ц-конце болтается, и главное инцидент не единичныи, с другими белками такое же, да, эти цинковые пальцы не связывают ДНК

yack
moderator
Москва, Россия

15.08.2005 18:25

URL #7

Да ладно шифроваться. E3-лигазы экспрессируете?

guest-n
Участник

15.08.2005 18:33

URL #8

Хороший вопрос. Не часто такие душевные вопросы бывают.
Пару раз бился с этой гадостью. Один раз не очень удачно, другой вполне нормально - до 5% от клеточного белка.
1. Проверьте то ли вы проклонировали. В экспрессируемом варианте могут быть замены!
2. Надо сделать конструкцию для наиболее хорошей экспрессии. У вас наилучший для этого модельный объект - делеция "пальца" на С-конце. Лучше не промотор десятого гена Т7, а, например, левый промотор лямбды. Тк транскрипция полностью в pET не подавлена. Или попробовать подавить всеми способами, как советует yack, еще лучше вставить дополнительный операторный участок на рсстоянии примерно 30 пар от имеющегося.
Или берите вектора pET со встречной транскрипцией генов устйчивости к антибиотикам. Можете еще добавить плазмиду с геном лак-репрессора из кюагеновской системы - помогает.
3. Надо открыть экспрессию на короткое время. То есть так подобрать условия выращивания, чтобы вы смогли накопить достаточно клеток в зарепрессированом варианте, но не состарить культуру. Затем один час экспрессия. Естественно, pLysS/E в этом варианте экпрессии использовать нельзя.

Поблагодарили (1): J

J
Постоянный участник
Цитадель Рос

15.08.2005 18:38

URL #9

2 yack

нет, не Е3, нафиг-нафиг

зинковые пальцы и у простых смертных елков встречаются

2 guest_n
Все понял попробую как-нить, с сиквенсом у меня все в порядке

Tom1
Постоянный участник

15.08.2005 18:53

URL #10

ИМхо може еще попробвать фаговую индукцию как например описано тут....
Mol Biol (Mosk). 1996 Sep-Oct;30(5):1096-106. .
[SegE endonuclease from phage T4. I. Cloning, expression, and biochemical characteristics of endonuclease activity]

Поблагодарили (1): J

guest-n
Участник

15.08.2005 19:24

URL #11

Да, вот Том правильно советует, если оно проклонировалось нормально, то фаговая индукция тоже самое оно, но лучше брать не СЕ6, а mGP 1-2 (Tabor, Richardson). СЕ6 часто ревертирует по гену холина - S и лизирует клетки, и вы можете завозиться с очисткой мутанта S7am от ревертанта. А с mGP 1-2 при высокой множественности инфекции (10-15 и более), да и выход обычно побольше, чем с СЕ6. Для mGP не забудьте нужны Ф+-клетки.

Поблагодарили (1): J

J
Постоянный участник
Цитадель Рос

15.08.2005 19:43

URL #12

ладно, буду знать

NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни

21.08.2005 08:53

URL #13

J,..

1. Вырасти пилот при 20C.
2. Перед индукцией: удвой начальную глюкозу (за 5 минут) и учетвери азот (за примерно два часа при 20С, за час - при 30С и за полчаса при 37), доведи Zn в среде экспрессии до 50 мкМ за 5 минут до индукции (в принципе, можно и до 100 если не получится, но у тебя палец - один).
3. В растворимые фракции срезов экспрессии часа, двух и четырёх часов добавляй СРАЗУ после разделения фракций лизата PMSF. Держи их во время выделения ВСЕГДА на льду. Используй только sonicator. Никаких френч прессов и китовых лизис эджентов. Все центрифуги И ИХ РОТОРЫ должны быть при +4.
Прямо перед соникейшеном тоже добавь PMSF в суспензию в лизис-буфере. Мера выглядит параноидальной, но иногда помогает. Соникейшн ТОЛЬКО ВО ВЛАЖНОЙ ЛЕДЯНОЙ БАНЕ. Никаких пробирок в руках на весу.

Причина в том, что твой палец режет протеаза в области линкера пальца и основного белка (этот линкер без сайта распознавания бесструктурен), без этого свёрнутого пальца белок, скорее всего теряет стабильность и/или экспонирует своё гидрофобное ядро протеасомам и протеазам. Посему - это разрушается быстрее, чем синтезируется. Аммоний своим азотом ингибирует синтез этих протеаз - его в культивационной среде должен быть избыток. В инклюжен бадиз этот белок не перейдёт никогда - он растворим в цитоплазме и слишком велик, чтобы скорость его синтеза была выше скорости протеолиза.
Надейся только на ингибирование протеаз и холод на всех этапах. Секвестрация цинка и его добавка в среду врятли причина отсутствия экспрессии.

NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни

21.08.2005 08:59

URL #14

Да, в пальцах цистеины любят окисляться, поэтому перед нагрузкой колодцев геля образцами не забудь BME. Если тебе важна нативная очистка и полноразмерный белок обратно не свернётся, то проблема на порядок сложнее, потому как цистеины всё равно перед очисткой придётся восстанавливать и доказать, что они не окислены перед кристаллизацией/функциональными активностными пробами. Если они окислены в апо-форме, палец - не будет вязать цинк и сворачиваться.

NMR-guy
Постоянный участник
временной жизни

21.08.2005 09:05

URL #15

П.П.С. У нас однопальцевые фрагменты не экспрессируются с pET21 ни при каких условиях. Нам их синтезируют химики.

Сообщение было отредактировано NMR_guy - 21.08.2005 09:06

guest-n
Участник

21.08.2005 22:55

URL #16

(NMR_guy @ 21.08.2005 09:53)

J,..

Держи их во время выделения ВСЕГДА на льду. Используй только sonicator. Никаких френч прессов и китовых лизис эджентов. Все центрифуги И ИХ РОТОРЫ должны быть при +4.
ТОЛЬКО ВО ВЛАЖНОЙ ЛЕДЯНОЙ БАНЕ. Никаких пробирок в руках на весу.

Да, температура очень существенна. Можно захолодить даже культуру прямым добавлением льда, если объем более 1 л. Или после индукции сразу в лед.

Поблагодарили (1): NMR_guy

nigoal123
IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE
гость

23.05.2022 12:12

URL #17

The secret to 123GOAL good article writing is to 11hilo understand how สล็อต123 to plan and structure a บาคาร่าออนไลน์ piece before slotxo you write it.

A well-structured ลิงค์รับทรัพย์ article allows you to use nigoal your writing skills to sexy gaming best advantage and dreamgaming communicate your ideas nigoal 50รับ100 correctly, concisely, clearly, coherently, and completely.

guest: 123
IP-штамп: frJhOCvSv9ICE
гость

02.06.2022 12:21

URL #18

For years there 123VEGA have been FA CHAI SLOT calls for Asia - which JILI SLOT is home to some PRAGMATIC PLAY of the world's สล็อตPG biggest CO2 emitters - to ditch fossil fuels 11HILO to help tackle climate AMB CASINO change. Countries in the region - including FC SLOT its three biggest economies 88KTC China, Japan and India - were criticised last year 123GOAL for not making a bigger.

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.