Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Alex IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
Метод может использоваться как самостоятельно так и в сочетании с центрифугированием в градиенте плотности Метод основан на способности изотонического раствора хлорида аммония гемолизировать эритроциты ------------------ материалы: 1. лизирующий буфер (раствор хлорида аммония) 2. суспензия клеток Если нет стандартного (коммерческого) лизирующего буфера для эритроцитов, готовят раствор (буфер) хлорида аммония. для этого нужно взять (на 500 мл. буфера): в сухой пробирке (фальконе) готовится смесь навесок сухих веществ - - хлорид амонния (NH4Cl) - 4.15 грамм - калия гидрокарбонат (KHCO3) - 0.5 грамм - ЭДТА (EDTA) - 15 миллиграмм смесь растворяется в 20-30 мл. дистиллированной автоклавированной воде, стерилизуется фильтрованием (через фильтр-насадку) и объём доводиться до 500 мл. (дистиллированной автоклавированной водой) pH=7.2-7.4 протокол: 1. взвесь клеток осаждают центрифугированием при комнатной температуре 2. осадок ресуспердируют в лизирующем буфере, из расчёта 300 миллионов клеток на 1 мл. буфера 3. суспензию оставляют на 7-10 мин. при комнатной температуре (до появления характерного цвета гемолиза - "лакированной крови") 4. разбавить суспензию 10-кратным объёмом PBS (среды), осадить центрифугированием --------------- примечания: - лизирующий буфер можно приготовить на основе Трис-буфера; - более 10 минут инкубировать в лизирующем буфере не рекомендуют из-за риска повреждения мембран других клеток; - если лизис произошёл неполностью процедуру можно повторить; - приведённая методика применима для клеток ЧЕЛОВЕКА литература: Лимфоциты - методы (ред. Д. Клаус) Москва, "Мир" 1990, с. 52-53 |
Варя IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
|
orun IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
По крайне мере(мне так кажется) один минус точно есть - всем остальным клеткам осомтический шок не может не вредить, и после лизиса эритроцитов в растворе много всякого мусора который также не может не вредить остальным клеткам. |
picarus IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
"-" мусор конечно есть... |
Alex IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
- быстрее (сокращение времени протокола) - дешевле - меньше потерь клеток ----------------------- минусы: - сохраняется риск повреждения мембраны других клеток (если передержать) - малопригоден для больших объёмов крови ------------------- вообще при объёмах > 20-30 мл. крови я использую комбинацию этих 2-х методов, поскольку после фиколла интерфаза редко идеально чистая без контаминации эритроцитами (если конечно кровь не тёплая была)... |
picarus IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
(\"Alex\") после фиколла интерфаза редко идеально чистая без контаминации эритроцитами (если конечно кровь не тёплая была)...
Гворят, если разбавить 1:1 юшку полиглюкином, то глюков никаких не будет, а вот эритроциты буду оседать дружнее и гораздо меньше будут липнуть друг к другу и к мононуклеарам. Тока вот в Филадельфии есть ли какие декстраны? |
Alex IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
это вопрос в криобанк РОНЦ Блохина и Гемабанк, они применяют этот метод, скоро должна появиться публикация на сайте об этом... Но мне кажется все эти навороты нужны когда ты с идеей в голове - сохранить максимум клеток: для клиники и для криоконсервирования... а нам в ресёче - дали 10 мл крови - довольны, дали 50 мл - тоже довольны, метод работает и ладно, клетки сохраняет нужные, на активность не влияет.... поэтому 50 лет фиколл и лизис.. |
Pazus IP-штамп: friYUXApcTu9A гость |
Слышал много об этом методе освобождения от эритроцитов, напишите пожалуйста кто знает, есть ли у этого метода какие нибудь плюсы по сравнению с осаждением на Фикол-Паке?
По крайне мере(мне так кажется) один минус точно есть - всем остальным клеткам осомтический шок не может не вредить, и после лизиса эритроцитов в растворе много всякого мусора который также не может не вредить остальным клеткам. Мы как-то по поводу мусора, который после лизиса остаётся, тоже задумались... Не отходя от кассы сделали вот что: На обычном геманализаторе прогнали цельную кровь, а потом - её же после лизирующего раствора (фирменного, кстати). Ну эритроциты, понятно, исчезли (куда ж им, беднягам, деваться-то), лейкоцитов чуточку убавилось (видать, не все лизис пережили), зато тромбоцитов прибор показал вдруг уйму. Предположительно, прибор просто ошмётки мембран эритроцитарных за тромбоциты принимал... Короче, решили, что грязно получается и на фиколле в итоге крутим. Да и так если посоображать... Гемолиз - он же явно даёт выброс факторов дифференцировки, которые не могут не повлиять (особенно, если речь о костном мозге). Помните, был раньше такой метод экзекуции у советской медицины - аутогемотерапия, когда кровь из вены брали и в задницу тут же вкалывали. Больно это было для данного места, сейчас уж так не делают, но эффект стимулирующий у этой процедуры всёж-таки был как раз за счёт того, что лизировавшаяся после внутримышечного введения кровища высвобождала факторы, стимулирующие эритропоэз, да и ваще всё помаленьку... А ведь если какой-то фактор успел на рецептор СК сесть, его уж, наверно, не отодрать, хоть крути на градиенте, хоть что делай... Хотя, может быть, на время лизиса рецепторы как-нить заблокировать можно... У кого какие мысли - поделитесь... По поводу: Гворят, если разбавить 1:1 юшку полиглюкином, то глюков никаких не будет, а вот эритроциты буду оседать дружнее и гораздо меньше будут липнуть друг к другу и к мононуклеарам.
Нельзя ли чуть подробней для с разгону не врубившихся? (заранее блгдрю...) |
guest: Михаил IP-штамп: fr4I3qoC2Qq4. гость |
|
Guest IP-штамп: frGhpw4XOJRLU гость |
(Alex @ 02.02.2005 07:18) Метод лизиса эритроцитов используется при выделении лейкоцитов, лимфоцитов, мононукларных и ядросодержащих клеток из крови, костного мозга, суспензии паренхиматозных органов (селезёнка, печень) Метод может использоваться как самостоятельно так и в сочетании с центрифугированием в градиенте плотности Метод основан на способности изотонического раствора хлорида аммония гемолизировать эритроциты ------------------ материалы: 1. лизирующий буфер (раствор хлорида аммония) 2. суспензия клеток Если нет стандартного (коммерческого) лизирующего буфера для эритроцитов, готовят раствор (буфер) хлорида аммония. для этого нужно взять (на 500 мл. буфера): в сухой пробирке (фальконе) готовится смесь навесок сухих веществ - - хлорид амонния (NH4Cl) - 4.15 грамм - калия гидрокарбонат (KHCO3) - 0.5 грамм - ЭДТА (EDTA) - 15 миллиграмм смесь растворяется в 20-30 мл. дистиллированной автоклавированной воде, стерилизуется фильтрованием (через фильтр-насадку) и объём доводиться до 500 мл. (дистиллированной автоклавированной водой) pH=7.2-7.4 протокол: 1. взвесь клеток осаждают центрифугированием при комнатной температуре 2. осадок ресуспердируют в лизирующем буфере, из расчёта 300 миллионов клеток на 1 мл. буфера 3. суспензию оставляют на 7-10 мин. при комнатной температуре (до появления характерного цвета гемолиза - "лакированной крови") 4. разбавить суспензию 10-кратным объёмом PBS (среды), осадить центрифугированием --------------- примечания: - лизирующий буфер можно приготовить на основе Трис-буфера; - более 10 минут инкубировать в лизирующем буфере не рекомендуют из-за риска повреждения мембран других клеток; - если лизис произошёл неполностью процедуру можно повторить; - приведённая методика применима для клеток ЧЕЛОВЕКА литература: Лимфоциты - методы (ред. Д. Клаус) Москва, "Мир" 1990, с. 52-53 |
harth |
|
Paintball Lover Moscow |
Сообщение было отредактировано Paintball Lover - 08.03.2021 22:34 |
kpscthulsaireal IP-штамп: frgslhp8UIlcc гость |
|
Guest IP-штамп: fr.NVsjeMyrXA гость |
|
CognitionUAE IP-штамп: frDOARyxhG/v. гость |
|
saharaindustry IP-штамп: frnyMKSIpYqjs гость |
|
Water IP-штамп: frZ.x31c6x1og гость |
|
Guest IP-штамп: frlTmWXmvNeFA гость |
Best Front Load Washing Machine in India Best Top Load Washing Machine in India |
hoobs008 |
|
ЛараЛим |
Подскажите кто-нибудь, пожалуйста, как долго можно хранить лизирующий раствор, приготовленный по прописи: хлорид аммония (NH4Cl) - 4.15 грамм - калия гидрокарбонат (KHCO3) - 0.5 грамм - ЭДТА (EDTA кислота, а не соль) - 15 миллиграмм, объем раствора 500 мл? У нас полученный раствор держит рН (7,2-7,4) нормально 2-3 дня, а затем рН сильно уходит в щелочную. |
guest: Mara IP-штамп: frYUDxQtTmM0s гость |
|
Jashwanth IP-штамп: frWwRJ.jgF6E6 гость |
|
foxximan |
Google Play Store. |
james2022 |
|
Guest IP-штамп: frPKI5JohN/MU гость |
(Pazus @ 27.03.2005 22:30) Мы как-то по поводу мусора, который после лизиса остаётся, тоже задумались... Не отходя от кассы сделали вот что:
На обычном геманализаторе прогнали цельную кровь, а потом - её же после лизирующего раствора (фирменного, кстати). Ну эритроциты, понятно, исчезли (куда ж им, беднягам, деваться-то), лейкоцитов чуточку убавилось (видать, не все лизис пережили), зато тромбоцитов прибор показал вдруг уйму. Предположительно, прибор просто ошмётки мембран эритроцитарных за тромбоциты принимал... Короче, решили, что грязно получается и на фиколле в итоге крутим. Да и так если посоображать... Гемолиз - он же явно даёт выброс факторов дифференцировки, которые не могут не повлиять (особенно, если речь о костном мозге). Помните, был раньше такой метод экзекуции у советской медицины - аутогемотерапия, когда кровь из вены брали и в задницу тут же вкалывали. Больно это было для данного места, сейчас уж так не делают, но эффект стимулирующий у этой процедуры всёж-таки был как раз за счёт того, что лизировавшаяся после внутримышечного введения кровища высвобождала факторы, стимулирующие эритропоэз, да и ваще всё помаленьку... А ведь если какой-то фактор успел на рецептор СК сесть, его уж, наверно, не отодрать, хоть крути на градиенте, хоть что делай... Хотя, может быть, на время лизиса рецепторы как-нить заблокировать можно... У кого какие мысли - поделитесь... По поводу: Нельзя ли чуть подробней для с разгону не врубившихся? (заранее блгдрю...) |
Guest IP-штамп: frPKI5JohN/MU гость |
|
guest: biggboss16 IP-штамп: freIvSbDj8rEg гость |
|
yousuf Постоянный участник |
|
gb ios x apk IP-штамп: frTV1uSyAhbIQ гость |
|
ryan77 |
|
Aatif Участник |
|
« Предыдущая тема · Клеточные технологии · Следующая тема » |