Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Sergeant Постоянный участник |
Чем лучше клетки инфицируем (трансфецируем) , тем меньше их выживает. поставлено масса контролей и эффект отлично воспоизводится. Помню вроде Stratagene сляпали менее токсичную версию GFP. Кто нибудь с этим работал? PS Даже разные методы делали: 1.Amaxa 2. Ретровирусы |
guest123 Участник |
|
yack moderator Москва, Россия |
|
guest123 Участник |
Mozhet bit', tol'ko v moem sluchae rech' idet imenno ob EGFP, a ne fusion s nim. |
kglebov Постоянный участник Германия Гёттинген |
|
Sergeant Постоянный участник |
Мрут, еще как мрут. У меня в ретровирус загнан EGFP из pEGFP-C3. Там где доза гена не высока клетки выжывают. Где доза гена побольше дохнут и перед смертью светят как фонари. В общем для меня EGFP не критичен. Он у меня сам как один из контролей. Но как в известном анекдоте " Вилки то нашлись, но осадок остался" Были у меня задумки позднее использовать его для фьюжена с другими белочками, но сейчас я в этом шибко сомневаюсь. |
legion Постоянный участник |
Ето личные данные феномен был нами обнаружен лет 5 назад. |
guest123 Участник |
Est' li kakie-nibud' opublikovannie dannie? |
legion Постоянный участник |
Ну а когда получилось что т.н отризател;ный контроль сам лизирует уже проверили на чистом и на разных клетках. Единстенное косвенное подтревждение этого факта стаtья каких-то японцев помню что в Febs. Они получали траnсгенных мышей и смотрели распределение GFP по тканям так вот и получалось что в клетках крови (еритроциты), мозга, и серца ) не было свечения а на вестерне GFP детектировался . Мы получили тоже самое еритроциты не светятся а в мемранной фракции GFP. Pочему холестерин т.к. если если еритроциты предварительно обработать выше перечисленными агентами (получить тени еритроцитов т.е. фактически одну мембрану) еффекта не наблюдается а если получать тени д.водой то все на месте. У мелитина дигитонима и стрептолизина мишень в мембране холестерин он им необходим для формирования пору. Во блин расписался [Текст переведён с транслита] [Текст переведён с транслита] |
Olegovitch Постоянный участник Cantabrigia, Anglia Oriens |
|
legion Постоянный участник |
В гругих типа меньше . косвенно подтверждается и таким фактом как лизиц различных типов клеток дигитонином и в сравнении со стрептолизином принцип лициса один и тот же взаимодействие с островками холестерина в мембране и образование "дырок" однако если оба агента очень хорошо лизируют еритроциты а дигитонин ( все лизирует) то стрептолизин на различных типах клеток показывает различную степень лизиса и даже используется как перентрирующий агетн для трансфекции ДНК в клетки млеков.Я постораюсь отыскать работу японцев и пошлю тебе. |
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
Dannye korfokora govoryat, chto dve treti v membrane tret' v vodnoj faze. Sam po sebe. No skol'ko v kletke membran? |
Olegovitch Постоянный участник Cantabrigia, Anglia Oriens |
Автор - Vadim Sharov: Rizzuto R, Brini M, Pizzo P, Murgia M, Pozzan T. в статье "Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells".Kto skazal, chto GFP po citisolyu ravnomerno raskidan? [Текст переведён с транслита] |
legion Постоянный участник |
Если есть желающе могу пульнуть данную статью [Текст переведён с транслита] [Текст переведён с транслита] |
Seva Участник |
|
Olegovitch Постоянный участник Cantabrigia, Anglia Oriens |
Не знаю, насколько нежными можно считать отцов русской демократии COS и HeLa, но до пятого дня с xFP под кондовым CMVшным промотором опосля душевной Fugenной трансфекции доживают немногие. |
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
Kstati pochemu takoj vybor COS i HeLa? Mozhet luchshe COS i CV1 (ili drugie martysh'i kletki). CV1 udobnee, oni, kazhis', imenno te kletki iz kotoryh COSy polucheny T bol'shim antigenom. Teper' o stat'e. K sozhaleniyu u nas tol'ko s 1999 Curr. biol. Ne pul'nyote? No dazhe v abstracte ukazano lish' o localisacii v cytozole. No o ravmomernosti raspredeleniya nichego ne skazano. Drugoj vopros, a kak posmotret'? Chto ne metod, to artefaktov polno. |
|
"High-level green fluorescence is easy to detect Low-toxic reporter does not interfere with expression of your gene Stable expression allows hrGFP for use in generating stable cell lines" .http://www.stratagene.com/displayProduct.asp?productId=239 |
guest123 Участник |
Is Green Fluorescent Protein Toxic to the Living Cells? Hsiao-Sheng Liu,1 Ming-Shiou Jan, Chao-Kai Chou, Ping-Hong Chen, and Nir-Jihn Ke Biochemical and Biophysical Research Communications 260, 712–717 (1999) |
gonzic Постоянный участник |
gonzic4hotbox.ru |
Olegovitch Постоянный участник Cantabrigia, Anglia Oriens |
|
legion Постоянный участник |
Masaru Okabe*, Masahito Ikawa, Katsuya Kominami, Tomoko Nakanishi, Yoshitake Nishimune FEBS 18458 FEBS Letters 407 (1997) 313-319 |
Olegovitch Постоянный участник Cantabrigia, Anglia Oriens |
|
galina Постоянный участник Москва |
Не могли бы Вы мне тоже прислать вышеназванную японскую статью (galinapo@vfil.ru). Я тоже сталкивалась с феноменом токсичности GFP, но подробно копать и разбираться как всегда не было времени да и особой необходимости. Но свербит. |
legion Постоянный участник |
[Текст переведён с транслита] |
legion Постоянный участник |
[Текст переведён с транслита] |
|
Сама процедура транс-(цис ), ин-(аут )фекции есть повреждающее воздействие и потому изначально число трансфецированных и выжывших обратно пропорциональны. А ГФП у меня экспресировались ну в очень больших количествах- клетки зеленели на глазах- и ничего. |
Olegovitch Постоянный участник Cantabrigia, Anglia Oriens |
все предельно просто - продолжительная экспрессия EGFP под сильным конститутивным промотором губит клетки. "Зеленеть на глазах" можно и при подтекании слабого индуцибельного промотора, и ничего. |
Sergeant Постоянный участник |
Я открывал этот топик то был в состоянии небольшого аффекта и абстрактного недовольства. За это время ситуация немного изменилась и я успокоился. Я уже писал, что в общем то мне GFP пофигу. Удобный контроль и более ничего. За две недели те клетки, кто сильно эксрессировал GFP счастливо передохли. остальные выжили и средненько или слабенько светятся. Но светится 100% клеток. Стабильная экпрессия. Я их пересеял. И после этого они нормально светят. вообще то я уже давно разочаровался во всяких трансфекционных реагентах и транзиентной трансфекции. Зря только теряю время и деньги. Вирусы намного удобней. последнюю партию ретровирусов получил- пальчики оближешь. Аденовирусы тоже работали не плохо. сейчас нет времени, но к концу года хочу еще попробовать AAV (helper free) и лентивирусы. И будет полный (относительно) боевой комплект. |
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
guest: 123vega IP-штамп: frXqkB4MpP2jQ гость |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
123goal 123goal Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |