molbiol.ru -> Базовые методы

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Базовые методы -- comments to a permanent page of the site --

Тема связана с: Основные приёмы работы
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Forum robot
Постоянный участник
на сервере в Москве

11.01.2006 02:07

URL #1

Комментарии к постоянной странице сайта: Базовые методы

Базовые методы работы с эукариотическими клетками. Снятие клеток с культуральных сосудов. Замораживание. Размораживание. Определение количества клеток. Транспортировка. Культуральная посуда. Приведена общая схема работы с эукариотическими клетками. Оптимальные условия, времена и концентрации для каждой конкретной клеточной линии подбираются опытным путем.

_Ella_
IP-штамп: frftLGqhpFF.A
гость

11.01.2006 02:08

URL #2

Довожу до сведения всех присутствующих, что ежели кто, желая снять эукариотические клетки с чашки Петри раствором Версена-трипсина, зальет их вместо этого содержимым стоящей рядом баночки с этанолом, пусть не беспокоится. Ничего страшного, не загнутся, спиртное в малых дозах полезно в любых количествах (спирт, правда, после запоздалого раскаяния лучше слить). Оно конечно не удивляет. Мы-то тоже вроде пока живы.

Olena Bilyk

22.02.2006 23:06

URL #3

Дорогие коллеги! Посоветуйте как заморозить клетки асцитической жидкости, взятые непосредственно у онкологических больных. Я первый раз с этим работаю, требуется совет.
Лена

Guest
IP-штамп: frkM0/MHHgnTA
гость

22.02.2006 23:16

URL #4

(Olena Bilyk @ 22.02.2006 22:06)

Точно также, как и все остальные клетки морозят. Сходите на сайт celltransplant.ru - много спецов по этой тематике.

Гость
IP-штамп: frFSEhx7pFQBo
гость

23.02.2006 18:52

URL #5

Уважаемые коллеги!

Подскажите пожалуйста как можно быстро, дёшево и сердито убить клетки в культуре?
Линия HaCaT(кератиноциты).

Заранее огромное СПАСИБО

гость: Ю
IP-штамп: frn63u3Akg/ZI
гость

09.03.2006 18:15

URL #6

(Гость @ 23.02.2006 17:52)

Guest
IP-штамп: frn63u3Akg/ZI
гость

09.03.2006 18:27

URL #7

(Гость @ 23.02.2006 17:52)

Можно использовать облучение ультрафилетом (минут 20), или митомицин С, 50 мкг/мл 1-2 час, или актиномицин Д (1-5 мкг/мл, колхицин и др клеточные яды и противоопухолевые химиопрепараты. А у меня к Вам вопрос как раздобыть клетки HaCaT? Уже давно ищу в бывшем СССР.
Заранее спасибо.

Гость
IP-штамп: frw3GfipDY0Lk
гость

10.05.2006 17:59

URL #8

Здравствуйте! Напишите ,пожалуйста,можно ли для снятия клеток NIH3T3 с чашки вместо трипсина использовать раствор Версена и как лучше это выполнить, чтобы получить максимально возможное количество клеток (надо для миграции)? заранее СПАСИБО.

ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

11.05.2006 12:07

URL #9

---Подскажите пожалуйста как можно быстро, дёшево и сердито убить клетки в культуре?
Линия HaCaT(кератиноциты).

НАГРЕТЬ ГРАДУСОВ ДО 50-60.

поменять рН запредельно, или налить окислителя. а еще формалинчик тоже хорошо.

bapik

12.09.2006 11:18

URL #10

Всем привет! Коллеги помогите пожалуйста, как прокультивировать некоторое время опухоль вынутую из животного, а потом сделать перевивку уже на несколько животных. Извиняюсь за сумбурное изложение, в таких делах я просто чайник. Посоветуйте, что почитать.
СПАСИБО.
Андрей.

Firefly76

28.11.2006 20:01

URL #11

Коллеги, посоветуйте, pls, что делать, если при культивировании клеток среда (DMEM/10%CBS) быстро защелачивается (приобретает фиолетовый оттенок. Клетки пойкилотермных животных, Т=26С, посуда NUNC. CO2 инкубатора нет, но введение газа в емкость не предотвращает этот процесс. ЗАРАНЕЕ БЛАГОДАРЕН.

Ksiysha

30.11.2006 17:21

URL #12

а клетки у вас там вообще делятся?

Ksiysha

30.11.2006 17:26

URL #13

(Гость @ 10.05.2006 17:59)

Можно и версеном, но подержать в инкубаторе придется подольше и снимать механически

Гость
IP-штамп: frGqyYT8IU7LU
гость

23.01.2007 17:50

URL #14

Глубокоуважаемые коллеги!
Посоветуйте простому генному механику...
Задача - зафиксировать клетки на чашке, затем провести иммуноокрашивание рекомбинантного белка.
Попробовали: фикс- 4%параформ на PBS+Tw20 0.01%, отмывка, иммуноокраш. с помощью Fab-фрагментов- POD, субстрат ТМБ.
Получилось грязно, видна только внеклеточная локализауия белка.
Кто-нибудь пробовал сапонин (? конц, время) для улучшения проникновения АТ в клетки?
И какие субстраты лучше для такой работы (есть Fab'ы меченные АР) Спасибо
кatia@ibch.ru

guest: ммм
IP-штамп: frHvyGooYAnV2
гость

24.01.2007 12:20

URL #15

---зафиксировать клетки на чашке.
Клетки то животные или бактериальные?
Если животные то можно попробовать мягкую фиксацию типа метанол уксус или 80% ацетон при этом и доступ к внутренностям клеточным открывается.

Получилось грязно, видна только внеклеточная локализауия белка.
Может это неспецифика? Клетки-то наверное можно отмыть как-то от внеклеточного белка перед фиксацией.

--есть Fab'ы меченные АР
Для такой хрени используют бром -хлор-индолил фосфат с нитросиним тетразолиевым в паре. Ну и буфер щелочной для субстрата.

curious67
Постоянный участник

18.02.2007 16:24

URL #16

2 guest: ммм
Спасибо за ответ!
Пробовала 80% ацетон и 4%парафрорм на PBS
С ацетоном лучше, для параформа требуется обработка сапонином (чтобы мембраны разрушились и АТ проникли внутрь).
А насчет отмывки - это не грязь и не неспецифика, белок имеет внутри- и внеклеточную локализацию (что видно на флуор. микроскопе, поскольку мы имеем дело с аналогом GFP).
А субстрат у меня ТМБ.
Он выцветает при хранении. Попробую этот ваш бром-хлор...
Спасибо за Ваши комментарии!!!

Guest
IP-штамп: frs8D3rPK85tc
гость

18.02.2007 17:04

URL #17

(curious67 @ 18.02.2007 15:24)

2 guest: ммм
Пробовала 80% ацетон и 4%парафрорм на PBS

curious67, Вы что, пол сменили?

curious67
Постоянный участник

18.02.2007 19:04

URL #18

быстрая реакция! Спасибо за внимание к моей персоне Это другой пользователь, который не спросясь зашел, но не в курсе несколько, как логиниться и тп. Потому как не имеет времени переливать из пустого в порожнее, как мы с Вами. Попробую убедить завести себе ник. Пока не обижайте уж

pchelinka
Участник

19.02.2007 09:44

URL #19

[Всем привет! Коллеги помогите пожалуйста, как прокультивировать некоторое время опухоль вынутую из животного, а потом сделать перевивку уже на несколько животных. Извиняюсь за сумбурное изложение, в таких делах я просто чайник. Посоветуйте, что почитать.
СПАСИБО.
Андрей.quote]

мы перевивали мышей сразу (не культивируя дополнительно) - вынутую из мышки опухоль, (асцитная или солидная), переносилась в буфер Хенкса, или в RPMI, объем которых должен быть небольшой - 1-2 ml и температуры чел тела (капля раствора на тыльной стороне руки не чувствуется). Далее концентрация клеток в растворе разводилась до 10*6 (степ) в ml и по 400-500 мкл вводилась в животное уколом в брюхо - для брюшного асцита. Для других опухолевых клеток перевиваемая концентрация может быть другая.

Гость
IP-штамп: frMBK77sTX3LI
гость

17.04.2007 10:26

URL #20

Дорогие коллеги,

Чем принципиально отличается работа с культурами клеток насекомых, например, от культур гибридом?
Мне скоро предстоит работать с первыми и хочется быть немножечко "в танке".....
Спасибо.....

kolya1984

26.10.2007 13:10

URL #21

Помогите пожалуйста. Кто знает что - нибудь про культивирование нервной ткани расскажите методику и материалы.

Bogatick

о-малое Москвы

07.11.2007 19:05

URL #22

Почему благодаря EDTA,содержащемуся в версене, клетки адгезионных культур сходят с поверхности? Почему лишение клеток двухвалентных ионов заставляет их "покидать насиженные места"?

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

07.11.2007 20:49

URL #23

---Почему благодаря EDTA,содержащемуся в версене, клетки адгезионных культур сходят с поверхности? Почему лишение клеток двухвалентных ионов заставляет их "покидать насиженные места"?

Грубо! - Между субстратом и рецепторами адгезии образуются кальциевые мостики.

типа СОО- +Са+ -ООС.

Bogatick

о-малое Москвы

08.11.2007 19:08

URL #24

ммм, спасибо

Гость
IP-штамп: frvwNYUDB8Upk
гость

12.11.2007 20:00

URL #25

можно ли заменить со2 инкубатор обычным термостатом при приготовлении препаратов хромосом клеток костного мозга для fish-диагностики и цитогенетического исследования.

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

12.11.2007 20:29

URL #26

Можно попробовать два варианта первый использоавать среду с HEPES буфером
второй ставить чашку в эксикаторе в котором погасла горящая свеча(от недостатка кислорода). Гарантий никаких при любом из способов, хотя первый предпочтителней.

Гость
IP-штамп: fr3PpYUagJAXg
гость

16.11.2007 14:21

URL #27

Bogatick /07.11.2007 19:05/
Почему благодаря EDTA,содержащемуся в версене, клетки адгезионных культур сходят с поверхности? Почему лишение клеток двухвалентных ионов заставляет их "покидать насиженные места"?

кадгерины кальций-зависимы

Гость
IP-штамп: fr3PpYUagJAXg
гость

16.11.2007 14:21

URL #28

Гость
IP-штамп: frG/ehwVgdnf.
гость

19.11.2007 12:32

URL #29

подскажите кто нибуть самый простой и ефективный метод приготовленния Brhadyrizobium japonicum для проведения фореза

polymerase

23.01.2008 23:19

URL #30

Объясните, пожалуйста.
Трансфекция эу-клеток.
Почему, когда мы проводим трансфекцию одновременно двумя плазмидами, считается, что во все клетки попадают обе? Пусть создается смесь трансфекционного реагента и двух плазмид, а затем раскапывается на клетки. Тогда, теоретически, у нас будет 4 вида комплексов: агент, не захвативший ничего, агент захвативший плазмиду1, плазмиду2 и обе. И, если в плазмиды включена кднк GFP, то визуально ну ни как отличишь эти комплексы ( ну то есть светится клеточка, а какая?)! Я в тупике.

Нора
Участник

05.06.2008 16:24

URL #31

Здравствуйте, коллеги! Подскажите, пожалуйста, при получении первичных кератиноцитов каким образом помещают биоптат в раствор диспаза? И каким образом наносить коллаген на культуральный пластик, в чем его предварительно растворить и чем дополнить?
Огромное спасибо!

myosotica Гость
IP-штамп: fra6xdMWXgbHc
гость

19.09.2008 13:33

URL #32

Здравствуйте коллеги!
Подскажите пожалуйста где можно найти протокол получения подкожных человеческих фибробластов? Очень нужно :mol:

chatter
Участник

19.09.2008 17:43

URL #33

(Гость @ 23.02.2006 18:52)

Хромпиком.

chatter
Участник

19.09.2008 17:53

URL #34

(polymerase @ 23.01.2008 23:19)

Один липофектаминовый комплекс включает в себя много-много плазмид. При эквимолярном соотношении векторов в смеси довольно сложно себе представить, как липофектамин матерясь ползает по пробирке, собирая исключительно GFP-вектора лишь бы вам нагадить.

Гость
IP-штамп: frDQwa9k7riYg
гость

09.02.2009 18:19

URL #35

Коллеги, есть серьезные подозрения, что фетальная сыворотка Hyclon заражена микоплазмой. После фильтрации предварительно вылеченные клетки вроде не приобретают микоплазму (по тесту с DAPI). Есть ли у кого-нибудь опыт очитки сыворотки (а е клеток) от микоплазмы? Сами клетки прекрано лечатся Mycoplasma Removing Agent производства ICN. Но с сывороткой непонятно что делать. Главное, много ее накупил.

Гость
IP-штамп: frltbIKmJu36Q
гость

27.02.2009 14:10

URL #36

это не чиститься, насколько мне известно, просто обращаетесь к производителю и они ОБЯЗАННЫ поменять вам сыворотку на нормальную

Guest
IP-штамп: frWNOAHXr90iU
гость

27.02.2009 20:36

URL #37

(Firefly76 @ 28.11.2006 19:01)

1. Если добавляете НЕРЕS, не добавлять.
2. Увеличить на порядок концентрацию клеток (если не слишком большая)
3. Увеличить концентрацию фетальной сыворотки (смело можно до 20%)
4. В свое время, когда у нас не было СО2 инкубатора , мы добавляли СО2 в эксикатор с помощью бытового сифона и балончиков с СО2 для сифонов (сейчас их продают для пистолетов), но добавляли каждые 6 часов и крышку эксикатора смазывали глицерином.
5. каждые 4 -6 часов менят среду культивирования на новую
Успехов

Гость
IP-штамп: fr84SLI.CBe9Q
гость

28.02.2009 02:31

URL #38

Коллеги помогите!!! Для отработки методики нужны эпителиальные клетки кишечника человека. Конечно хотелось бы нормальных не раковых клеток, но вряд ли существуют такие клеточные линии. Подскажите пожалуйста какую использовать клеточную линию которая максимально сохранила свойства эпителия кишечника человека.

katya-akts
Участник
Москва

16.03.2009 15:32

URL #39

Вопрос к Гостю, писавшему про сыворотку HyClone и микоплазму:
не могли бы Вы уточнить номер партии сыворотки, на которую такие подозрения?

моя почта katya_akts{sobaka}mail.ru

galina.glousker

22.03.2009 14:47

URL #40

Уважаемые коллеги, нужен совет: культура неиммортализованных человеческих фибробластов ночь простояла в пониженной концентрации углекислого газа - кто-то умный перекрыл вентель на баллоне. Клетки вроде живы, но мы работаем с ДНК - кто-нибудь знает, насколько серьезны могут быть повреждения у выживших клеток и как это проверить? Заранее спасибо

Гость
IP-штамп: fr7Ufi3qeYVAg
гость

27.03.2009 11:00

URL #41

Добрый день!
Подскажите, пожалуйста!
Я хочу выделить белок из эндотелиальных микрочастиц плазмы крови - как можно разрушить мембрану, но так, чтобы не денатурировал белок? - Может быть, ультразвуком, но в течение какого времени?

Гость
IP-штамп: frlnAsDr.5x7A
гость

02.04.2009 14:36

URL #42

Здравствуйте, подскажите , пожалуйста, как фиксировать клетки млекопитающих, чтобы посмотреть внутриклеточную локализацию рекомбинантного белка с GFP?

alsan

25.10.2014 20:52

URL #43

Подскажите пожалуйста, как организовать работу с суспензионными культурами клеток. В каких колбах качать, какие крышки можно использовать? Или только Corning PC c вент крышкой?

MMM
Постоянный участник

26.10.2014 08:23

URL #44

(alsan @ 25.10.2014 21:52)

Если вы не собираетесь растить их мегалитрами, то подходит ЛЮБАЯ культуральная посуда для адегизионных культур. Так же можно использовать ПС чашки для бактерий. Качать в колбах низя. Они не бактерии потоки жидкости не любят. Их если в масштабах литров растят, то при ооочень медленном перемешивании в лабах обычно с помощью ролерной технологии, а в производстве в спец ферментерах.

alsan

26.10.2014 16:37

URL #45

Т.е. суспензию без перешивания? В CO2? Или можно и с резиновой крышкой?

guest: ммм
IP-штамп: frQlBxj4iQSg.
гость

26.10.2014 18:07

URL #46

В СО2 конечно, бЕз СО2 можно, но на спец среде и не всякую суспензию. При большом объеме - сотни мли более - либо нужно много мелкой посуды, либо все таки перемешивание нужно но мееедленное типа один цикл в 5-10 минут, можно еще медленнее.

Dr. Lektor

03.08.2016 13:21

URL #47

Уважаемые коллеги. Подскажите пожалуйста как получить чистую линию макрофагов человека из венозной крови, как их содержать и какова их жизнеспособность?
Заранее благодарен.

CowDoc
Постоянный участник
Middle East

20.09.2016 19:07

URL #48

(MMM @ 26.10.2014 08:23)

Качать в колбах низя. Они не бактерии потоки жидкости не любят. Их если в масштабах литров растят, то при ооочень медленном перемешивании в лабах обычно с помощью ролерной технологии, а в производстве в спец ферментерах.

Не слушайте! Все зависит от вида клеток и среды. И опыта. Посмотрел бы я на вас, как бы вы [/b]очень медленно перемешивая выращивали бы простейшие BHK-21

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.