Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
Стоит задаяа - очистить рекомбинантный белок с His-tag от урезанных форм и агрегатов на силикогельевой колонке для HPLC с фенильной прививкой в градиенте 2M (NH3)2SO4, подкисленный 0.1% трифторуксусной кислотой / бидистилированная H2O . Белок и его урезанные формы и агрегаты предварительно получены солюбилизацией телец включения и очисткой на Ni-NTA агарозе (элюция имидазолом). Эксклюзивную хроматографию использовать нельзя, так как образца очень мало - он используется под иммунизацию мышей для гибридом. Образец находится в буфере с сахарозой (выпадает в осадок без сахарозы или глицерина при замораживании). Очищать получается, но в системе присутствует ДНК. ДНК фрагментировали ультразвуком, затем обрабатывали ДНК-азой. Но что-то осталось. Фенилка имеет слабый положительный заряд, снять ДНК с нее получалось в солевом буфере, блокирующем отрицательный заряд фосфатов, с градиентом. Колонка не убилась так как использовал предколонку. По спектру на 254 нм было ясно видно что идет ДНК. (Прибор Agilent 1100). Что лучше делать: 1. Обработать ультразвуком, затем ДНКазой. 2. Осадить 3. Осадить + заряженным хроматографическим сорбентом (Q-сефароза, DEAE) Пробовал методы 1 и 3. ДНКаза работет не полностью, возможно надо диализировать в буфер, в котором она работет лучше. Один ультразвук не вариант - он только фрагментирует ДНК, а не удаляет. при выполнении метода 3 белок связывется с сорбентом сильнее чем ДНК. Методом 2 не решил воспользоваться так как остаток полиэтиленимина может намертво сесть на фенилку. 4. Может как-то использовать центрипреп? Как валидировать очистку? Пробовал при помощи спектрофотометра как 254 нм так и сканировать спектр 200 - 300 нм. Но что-то выглядит неубедительно. Кстати, взаимодействуя с белком ДНК меняет спектр поглощения. Но это не главное. Буду благодарен за любую помощь. Сообщение было отредактировано KCN - 09.07.2018 19:23 |
Panaev Постоянный участник |
Валидируют обычно уже разработанный процесс, а вы не знаете, как от ДНК очиститься. Да еще и процесс далек даже от экспериментального уровня производства. Что там валидировать? Вам таки разработать или валидировать? |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
Так же это изложено в USP, BP, EP. Есть порог чувствительности метода, но даже если ПЦР не обнаруживает копий вектора, они все равно там присутствуют в подпороговом количистве. Более того, при промышленной очистке от ДНК, целые молекулы ДНК попадают в конечную фракцию белка. Поэтому, они будут медленно, но уверенно забивать колонку, особенно если колонка минипреапаративная, годная для аналитики. Логично, что без предколонки работать нельзя. Или надо подбирать сорбент и буфер, чтобы высадить ДНК на самонабивной колонке на FPLC. Сообщение было отредактировано KCN - 11.07.2018 05:54 |
vb Постоянный участник |
ну допустим, аббревиатуру rt-pcr даже в урюпинске применяют в смысле пцр с обратной транскрибцией. Обычно пишут qPCR. ну допустим, вам еще и сам медод контроля нужно будет валидировать. А валидировать пцр доя контроля остаточной днк нетривиальная задача. Так как в отличие от ваших представлений у пцр чувствительность сильно выше критерия приемлемости. Сколько у вас там критерий приемлемости? 10 нг/доза или 5? ну допустим, есть и другие suitable methods. ну допустим, не надо так гордо размахивать юэспи и бипи. В родной гф 13 это тоже есть. Ну и вершина - промышленная колонка минипрепаративная, годная для аналитики! Я это даже запишу где-нибудь. Вы точно понимаете, чем занимаетесь? |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
Что касается минипрепаративной колонки - то вы когда-либо слышали, что такое масштабирование? Или низкие температуры тундры российской необъятной паталогически влияют на уши? Запишите себе, и обязательно добавте к тому, что для очистки белка для иммунизации животных ПРОМЫШЛЕННАЯ колонка НЕ требуется, поскольку в промышленных масштабах животных НЕ иммунизируют. Из них получают гибридомы, из которых потом чистят антитела, вот там уже и используют промышленные колонки. Для очистки белка для иммунизации нужны какие-то микрограммы, но желательно, очень чистого белка, без агрегатов, урезанных форм и белков клеток хозяина. Более того, в данной ситуации важна очистка белка от ДНК чтобы не убить колонку, а не из-за потенциально онкогенных эффектов на организм - мышек не жалко, у них и так иммунные клетки нужной специфичности появляются, даже если в белке будет ДНК. "Вы точно понимаете, чем занимаетесь?" - более чем вы себе представляете, в условиях весьма скудных ресурсов и оборудования. Сообщение было отредактировано KCN - 11.07.2018 14:59 |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
Reverse transcription PCR может выполняться и в обычном циклере, без детекции, с последующим разделением продуктов в агарозном геле. Это полуколичественный метод в такой постновке. Так что не всегда reverse transcription PCR = qPCR. Сообщение было отредактировано KCN - 11.07.2018 08:53 |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
Я уже чистил этот белок на HPLC, условия подобраны, но пришлось промывать предколнку отдельно , чтобы снять ДНК буфером с солью, экранирующей негативные заряды фосфатов. ДНК приводит к существенному возрастанию давления , а когда сходит с сорбента, дает пик на 254 нм. И это после ультразвука и ДНК-азы EN 0521 DNA-se I Fermentas. Но больше эту эквилибристику делать как-то неохота. Сообщение было отредактировано KCN - 11.07.2018 10:03 |
vb Постоянный участник |
(KCN @ 11.07.2018 04:02) Так и пугайте в Урюпинске своей PCR пьяных медведей, в обнимку с ГФ13. У нас в Украине ваша ГФ13 является просто макулатурой, пригодной для того, чтобы заворачивать в нее сало. Так как не гармонизирована с EP и BP, частично с USP, в то время как ДФУ - большей частью гармонизирована, за исключением N - статей (Nationality). Что касается минипрепаративной колонки - то вы когда-либо слышали, что такое масштабирование? Или низкие температуры тундры российской необъятной паталогически влияют на уши? Запишите себе, и обязательно добавте к тому, что для очистки белка для иммунизации животных ПРОМЫШЛЕННАЯ колонка НЕ требуется, поскольку в промышленных масштабах животных НЕ иммунизируют. Из них получают гибридомы, из которых потом чистят антитела, вот там уже и используют промышленные колонки. Для очистки белка для иммунизации нужны какие-то микрограммы, но желательно, очень чистого белка, без агрегатов, урезанных форм и белков клеток хозяина. Более того, в данной ситуации важна очистка белка от ДНК чтобы не убить колонку, а не из-за потенциально онкогенных эффектов на организм - мышек не жалко, у них и так иммунные клетки нужной специфичности появляются, даже если в белке будет ДНК. "Вы точно понимаете, чем занимаетесь?" - более чем вы себе представляете, в условиях весьма скудных ресурсов и оборудования. Продолжайте заворачивать сало. про промышленную хроматографию на аналитической колонке не я написал. Впрочем, по теме сабжа - зачем вам в вашей кустарщине валидация? Ну почистили микрограммы, ну вкололи для получения гибридом. Валидация-то тут причем? Или слово красивое? Забудьте. Подберите условия очистаи на анионообменнике и работайте себе с миром на своей украине. |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
Что касается вашей ГФ13, до того как защитить диссертацию, я работал на фармкорпорации. И как ни странно, регистрировал в Украине субстанции - рекомбинантные белки in bulk, производимые одной небезизвестной фирмой из России, называть ее я не буду. Так как я был инженером-технологом в R&D, то моя часть была модуль 3 CTD, качество. Там была жуткая несходимость по всем параметрам с ведущими фармакопеями мира, не говорю уже о нашей ДФУ. Практически по всем испытаниям. Ваша ГФ является прямым потомком фармакопеи СССР, и она настолько уклонилась в своем развитии от мировых фармакопей, что начала создавать трудности для выхода ваших фармкомпаний на мировой рынок. Российское АНД не подошло. Пришлось писать свое АНД на контроль качества субстанции, уже согласно требованиям ЕР и ДФУ. Но вашу валидацию техпроцесса мы подтвердить не смогли. И валидировать аналитические методики - это тоже обязаность инженера технолога R&D, и геморрой с этим был еще тот. Тем не менее, российский продукт был качественный и испытания выдержал. Но это уже оффтопик. Что касается ионообменников, то они связывают белок сильнее, чем ДНК. Уже проверил. Спиртом высаждать тоже не вариант, но попробовать можно. Можно попробовать и высолить сульфатом аммония. Для "человеческого употребления" сульфат аммония в биотехнологии запрещен, по крайней мере у нас в Украине. Но мышкам колоть после него белок можно. Но контролировать наличие ДНК все таки надо, чтобы не убить колонку. ПЦР и праймеров у меня нету, надо попробовать СФ. Есть какая-то формула, когда-то видел, в Скоупсе, в "Методах выделения белка", есть формула, подставляя значения поглощения на СФ на волнах 254 и 280 нм можно вычислить количество ДНК и степень связывания с белком. Надо найти и попробовать. |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
|
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
Проверить , ушла ли ДНК из расствора рекомбинантного белка можно при помощи ПЦР на Т3-Т7 праймеры (или Т5 - там в зависимости от плазмиды, сиквенирующие праймеры) для плазмиды и праймерами на 16S рРНК гены - на геномную ДНК. Так пишут в литературе по поводу подтверждения удаления ДНК продуцента бактериального типа. Эти праймеры есть в продаже, уже готовые, поэтому к ним есть документация, что облегчает подтверждение качества. |
LMP Постоянный участник |
(KCN @ 18.07.2018 11:08) праймеры то да есть, а вот уровень загрязнения ДНК они вам покажут или вам не актуально?
|
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
(LMP @ 18.07.2018 18:36) Мне как раз и надо оценить количество геномной и векторной ДНК, которая загрязняет рекомбинантный белок. Загрязнение ДНК другими ДНК или РНК меня не интересует. Важен факт подтверждения избавления от ДНК при помощи УЗ и ДНК-азы. Я ж не ДНК чищу, а белок. |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
(LMP @ 18.07.2018 18:36) Ваше сообщение натолкнуло меня на следующую мысль. Что если использовать процедуру очистки ДНК при помощи фенольного метода? Можно ее использовать для очистки белка. Только водную фазу с ДНК/РНК откинуть, а фенольную с белком собрать. Далее в фенол добавить петролейный эфир и гексан для снижения поверхностного натяжения и температуры кипения смеси. Отогнать огранику при температуре +35С, чтобы не коагулировать белок. Осадок белка расстворить в PBS рН 7.4 или TRIS HCl. Отобрать пробу на ПЦР как из расстворенного очищенного белка так и из откинутой фракции ДНК в водной фазе. Если в рекомбинантном белке нет ДНК, его можно наносить на колонку. Сообщение было отредактировано KCN - 18.07.2018 23:19 |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
Для получения моноклонов на линейный эпитоп это не критично. Если надо детектировать пространственный эпитоп, например комплекс лиганд-рецептор , то лучше использовать поликлоны, полученные путем иммунизации мышей комплексом лиганд-рецептор. Это по нашим данным. |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
Triton и SDS и другие детергенты, используемые для солюбилизации телец включения, садяться на силикогель с фенильной прививкой, модифицируя поверхность сорбента. Отмыть от ионных детергентов колонку тяжело. Хотя 1% SDS в виде инъекции можно вводить в случае намертво севших на колонку белков. Но лучше их отмывать градиентом ddH2O/ Acetonitrile 100%. [ Reversed-Phase Column Cleaning: SDS is OK, Vydac Advances, Grace/Vydac (The Separations Group (Hesperia, California, Winter 1998).] |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
(KCN @ 19.07.2018 08:35) По идее, после фенола с белком ничего плохого не случится, так как белок НЕ ренатурированный - он получен путем солюбилизации телец включений и очистки на Ni-NTA. Там хватает как урезанных форм так и внутримолекулярных и межмолекулярных агрегатов. Для получения моноклонов на линейный эпитоп это не критично. Если надо детектировать пространственный эпитоп, например комплекс лиганд-рецептор , то лучше использовать поликлоны, полученные путем иммунизации мышей комплексом лиганд-рецептор. Это по нашим данным. Собственно, с чего я начал огород городить, чтобы было понятно. Если иммунизировать животных смесью межмолекулярных и внутримолекулярных агрегатов, урезанных форм и нормального белка, получаются гибридомы, продуцирующие кросс-реактивные антитела. В итоге специфичность тестсистем на основе этих моноклонов серьезно падает, из-за перекрестных реакций с другими белками. |
vb Постоянный участник |
(KCN @ 19.07.2018 07:55) Собственно, с чего я начал огород городить, чтобы было понятно. Если иммунизировать животных смесью межмолекулярных и внутримолекулярных агрегатов, урезанных форм и нормального белка, получаются гибридомы, продуцирующие кросс-реактивные антитела. В итоге специфичность тестсистем на основе этих моноклонов серьезно падает, из-за перекрестных реакций с другими белками. Ну это, если про селекцию клонов вам не рассказали в свое время. Хотя, проблема вообще даже не в этом. Вся эта возня с днк - пустое. |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
|
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
(vb @ 19.07.2018 21:36) Ну это, если про селекцию клонов вам не рассказали в свое время. Хотя, проблема вообще даже не в этом. Вся эта возня с днк - пустое. Персональноя я гибридомы не веду. Это делают дэвочки Селекцию клонов я проводил на фаговом дисплее для scFv - одноцепочечных миниантител, фаг М13. Делал библиотеки, ставил пенинг, отбирал клоны, анализировал. Руководство прикрыло эту тему ввиду сложностей ренатурации scFv - выход составлял 9-15%. И это были далеко не первые белки, которые мы ренатурировали. С другими было лучше. Сообщение было отредактировано KCN - 22.07.2018 11:42 |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
Для того чтобы не тратить рекомбинантный белок, потренировался на лизоциме из куринного яйца и на человеческом сывороточном альбумине. Оба белка расстворил в буфере PBS pH 7.4, добавил фенольную фазу, размешал на vortex. Собрал фенольную фазу, добавил гексан и петролейный эфир. Произвел отгонку. Белок сформировал хлопьеорбразный осадок после отгонки органики. Повторное расстворение в PBS произошло не полностью - белок плавал агрегатами, хлопьями, появилась муть. Колоть такое в хроматограф - убить колонку. В лучшем случае очитститься трипсином на ночь с последующим градиентом ddH2O / acetonitrile. Такое поведение белка связано с тем, что формеруемый гидрофобными остатками кор белка разворачивается в огранических расстворителях и полностью денатурирует. При отгонке и переводе в водную фазу коровые гидрофобные аминоксилоты разных полипептидных цепей принадлежащих разным молекулам взаимодействуют между собой, вытесняя воду и образуют межмолекулярные агрегаты, непригодные для хроматографирования и иммунизации животных. Поэтому вопрос об анализе полноты удаления ДНК из такой системы отпал сам собой. Будем использовать УЗ и ДНК-азу. |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
|
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
|
Добрыня Никитич |
(KCN @ 09.07.2018 20:22) Добрый день всем! Стоит задаяа - очистить рекомбинантный белок с His-tag от урезанных форм и агрегатов на силикогельевой колонке для HPLC с фенильной прививкой в градиенте 2M (NH3)2SO4, подкисленный 0.1% трифторуксусной кислотой / бидистилированная H2O . Белок и его урезанные формы и агрегаты предварительно получены солюбилизацией телец включения и очисткой на Ni-NTA агарозе (элюция имидазолом). Эксклюзивную хроматографию использовать нельзя, так как образца очень мало - он используется под иммунизацию мышей для гибридом. Образец находится в буфере с сахарозой (выпадает в осадок без сахарозы или глицерина при замораживании). Очищать получается, но в системе присутствует ДНК. ДНК фрагментировали ультразвуком, затем обрабатывали ДНК-азой. Но что-то осталось. Фенилка имеет слабый положительный заряд, снять ДНК с нее получалось в солевом буфере, блокирующем отрицательный заряд фосфатов, с градиентом. Колонка не убилась так как использовал предколонку. По спектру на 254 нм было ясно видно что идет ДНК. (Прибор Agilent 1100). Что лучше делать: 1. Обработать ультразвуком, затем ДНКазой. 2. Осадить 3. Осадить + заряженным хроматографическим сорбентом (Q-сефароза, DEAE) Пробовал методы 1 и 3. ДНКаза работет не полностью, возможно надо диализировать в буфер, в котором она работет лучше. Один ультразвук не вариант - он только фрагментирует ДНК, а не удаляет. при выполнении метода 3 белок связывется с сорбентом сильнее чем ДНК. Методом 2 не решил воспользоваться так как остаток полиэтиленимина может намертво сесть на фенилку. 4. Может как-то использовать центрипреп? Как валидировать очистку? Пробовал при помощи спектрофотометра как 254 нм так и сканировать спектр 200 - 300 нм. Но что-то выглядит неубедительно. Кстати, взаимодействуя с белком ДНК меняет спектр поглощения. Но это не главное. Буду благодарен за любую помощь. Блин, ну HPLC используется для очистки низкомолекулярных веществ, а для очистки белков используется FPLC Вы точно понимаете что вы делаете? |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
Если колонка забивается белком, например остатками фибриногена, я обычно прокачиваю трипсином в соответствующем буфере, и оставляю в нем систему на ночь. Утром промывают и все работает. Больше всего мне нравится возможность различать белок на C18-C8-фенилке и других колонках этого типа при разнице в одну аминокислоту, даже незаряженную. И связка HPLC-масспектр себя хорошо зарекомендовала. Для рекомбинантных пептидов и белков есть смысл ставить предколонку. Набивают ее при помощи FPLC packing chamber, если набить вручную высокое давление спрессует сорбент и будет пузырь с буфером. Пакующая камера позволяет не пускать сорбент в буфере через насос FPLC, а выдавливать его в колонку или предколонку как из шприца. Есть специальные аппараты для паковки колонок и предколонок, но они дороже чем пакующая камера и узкоспециализированны. В них нет особого смысла. Если предколонку забьет ДНК, ее можно отсоединить от колонки и промыть буфером с ДНКазой, оставив так же на ночь. Это я пока не пробовал. Сообщение было отредактировано KCN - 11.10.2018 14:45 |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
Хорошие колонки для работы: 9.4 мм и 21.2 мм в диаметре - это минипрепаративные и препаративные колнки, позволяют очистить от 15 до 50 мг материи. НО: на прибор Agilent 1100 производитель НЕ рекомендует ставить колонки "толще" 9.4 мм, т.е. только минипрепаративные. Ну, мне достаточно. Притом для пептидов и белков рекомендуют С18, фенилку считают менее подходящим вариантом. P.S.: Протокол чистки трипсином, может кому понадобится: 180 минут со скоростью подачи трисового буфера рН 7.4 0.15 мл/мин, инъекция трипсина ( до 1 мкг/мл), 100 мкл, температура 36С, колонка 4.7x250 мм. Чиститься отлично, после трипсина можно промыть градиентом буфер/30% изопропанол, со скоростью 0.3 мл/мин, так как изопропанол очень вязкий, вымывает остатки трипсина и пептиды. Сообщение было отредактировано KCN - 11.10.2018 14:48 |
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
Choose: 80Å for < 4 - 5 kD 300Å for > 4 - 5 kD 1. Protein Separations Reversed-Phase Columns C18 StableBond (80Å) Reversed-Phase HPLC Columns ZORBAX StableBond Columns (80Å) Ordering Information Semi-Preparative 9.4x250 mm,5 mkm, 880975-202 2.Protein Separations Reversed-Phase Columns C18 ZORBAX StableBond (300Å) Column Ordering Information Semipreparative 9.4x250 mm, 5 mkm, 880995-202 Притом для пептидов и белков производители рекомендуют С18, фенилку считают менее подходящим вариантом. И система буфер1/буфер2+ацетонитрил %, с вариациями с ТФУ. А не 2М (NH4)2SO4/ddH2O и фенилка. Сообщение было отредактировано KCN - 11.10.2018 15:38 |
guest: great IP-штамп: frj5GEfdEWR5M гость |
|
KCN Постоянный участник Київ. Україна понад усе! / DELETED |
1. The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC, the Grace Vydac Technical Support Group. 2. The Handbook of Analysis and Purification of Peptides and Proteins by Reversed-Phase HPLC Presented by Vydac (The Separations Group). 3. HPLC of Peptides and Proteins: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology) Hardcover – December 15, 2003 by Marie-Isabel Aguilar 4. Руководства к колонкам Zorbax 300SB-C18, SB-C18, SB-300 C8, 300 SCX, ODS C18, Zorbax phenyl , GF-450, GF -250, Eclipse XDB-C18, TSK SP-5PW , TSK G3000SW, TSK CM-3SW, 4.6/9.4 mm и толще, толще... Сообщение было отредактировано KCN - 13.12.2018 14:21 |
guest: 123 IP-штамп: frJhOCvSv9ICE гость |
|
guest: 123 IP-штамп: frXqkB4MpP2jQ гость |
|
guest: 123 IP-штамп: frpYd0YygcNIA гость |
|
12 IP-штамп: frAWeMdOsBSXM гость |
|
« Предыдущая тема · Биофизика и матметоды в биологии · Следующая тема » |