molbiol.ru -> Микоплазма

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Микоплазма -- Обнаружение микоплазмы с помощью PCR. --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Kucha

Юбилейный

29.08.2007 09:30

URL #1

Здравствуйте коллеги!
Мы пытаемся разработать ПЦР метод обнаружения микоплазмы по следующей статье (смотрите закачку)

Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines
Uphoff, C.C., Drexler, H.G.
In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal, Springer New York, vol. 38, no. 2, pp. 79-85

Праймеры уже есть , но нет внутреннего контроля и вот он вопрос, кто нибудь делал внутренний контроль? Как его делать? он нужен? и еще, люди добрые, можете поделиться микоплазмой или клетками зараженными микоплазмой для положительного контроля)
если кто нибудь уже пробовал этот метод, расскажите пожалуйста о подводных камнях... если это не секрет конечно!

i1543_706X_38_2_79.pdf
размер: 547.94к
кол-во скачиваний: 12
29.08.2007 — 12.09.2007

Lebanon
IP-штамп: fr04Qan1zmBhk
гость

29.08.2007 10:26

URL #2

Так метод то уже давно разработан и используется для детекции микоплазм в клеточных культурах. Это давняя разработка НИИ Цитологии в Санкт Петербурге.

Kucha

Юбилейный

29.08.2007 15:20

URL #3

Наверное, я неправильно выразилась, просто пытаемся у нас в лаборатории использовать этот метод! и не совсем получается, дело упирается во внутренний контроль и положительный контроль... Было бы полезно пообщаться с человеком , кто разбирается)

Lebanon
IP-штамп: fr04Qan1zmBhk
гость

30.08.2007 02:31

URL #4

Не могу сказать, мы покупаем в Питере клеточные культуры и они уже готовые проверенные на микоплазму.
НИИЦитологии есть авторское свидетельство на эту методику еще советских времен, в любом случае я не представляю микоплазм существует более 150 видов а как эта методика может охватить хотя бы 20 специфических видов понятия не имею. Но должен отметить, что клеточные культуры получаемые из Питера таки чистые и не контаминированные микоплазмой. Видимо они настроили методику на несколько видов микоплазм типа hominis;equis и др наиболее часто встречаемые. А вообще чем морочить себе голову ПЦР методикой проще сделать посев на полужидкий агар Хейфлика и если микоплазмы есть в клеточной суспензии или культуральной жидкости они в течение 7 дней наверняка вырастут.

Kucha

Юбилейный

30.08.2007 08:12

URL #5

Спасибо)

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

30.08.2007 10:25

URL #6

Внутренний контроль - это вторая ПЦР система (праймеры+матрица), работающая в той пробирке и показывающая на оптимальные условия протекания реакции. Иногда изготавливают матрицу, отличающуюся размером. составом и т д, но имеющая те же сайты отжига что и данная пара праймеров (в Вашем случае на Myc. sp.). Такие вн. контроли называются конкурентными (компетиторными) и применяют для количественной оценки матрицы. Хотя любой внутренний контроль оказывает конкуренцию основной реакции и это надо помнить всегда.

Может стоит поискать другую статью про внутренний контроль,

и делать все как "у них" и будет на кого сваливать. Ничего Вы не "разрабатываете", будьте поскромнее!

Извините.
ЗЫ Когда эти праймеры будут обнаруживать микоплазму везде, даже в воздухе, Вас ждет другой уровень повышения квалификации.

А пока...

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

30.08.2007 12:18

URL #7

(Kucha @ 29.08.2007 09:30)

Здравствуйте коллеги!
Мы пытаемся разработать ПЦР метод обнаружения микоплазмы по следующей статье (смотрите закачку)

Цомпаративе ПЦР аналысис фор детецтион оф мыцопласма инфецтионс ин цонтинуоус целл линес
Упхофф, Ц.Ц., Дрехлер, Х.Г.
Ин Витро Целлулар & Девелопментал Биологы - Анимал, Спрингер Нещ Ёрк, вол. 38, но. 2, пп. 79-85

Праймеры уже есть , но нет внутреннего контроля и вот он вопрос, кто нибудь делал внутренний контроль? Как его делать? он нужен? и еще, люди добрые, можете поделиться микоплазмой или клетками зараженными микоплазмой для положительного контроля)
если кто нибудь уже пробовал этот метод, расскажите пожалуйста о подводных камнях... если это не секрет конечно!

i1543_706X_38_2_79.pdf
размер: 547.94к
кол-во скачиваний: 12
29.08.2007 — 12.09.2007

покрасте клетки ДАПИ и посмотрите в микроскоп - микоплазма будет светится на клетках- чистые клетки - токма ядро

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

30.08.2007 12:21

URL #8

(Kucha @ 29.08.2007 09:30)

i1543_706X_38_2_79.pdf
размер: 547.94к
кол-во скачиваний: 12
29.08.2007 — 12.09.2007

а если просто купить а не разрабатывать

http://www.promokine.de/index.php?id=23

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

30.08.2007 12:32

URL #9

(Kucha @ 29.08.2007 09:30)

i1543_706X_38_2_79.pdf
размер: 547.94к
кол-во скачиваний: 12
29.08.2007 — 12.09.2007

вашим набором вы будете тестировать Так ПОЛИМЕРАЗЫ , БСА, ХОТСТАРТ АНТИТЕЛА
и прочие КОМПОНЕНТЫ ПЦР МИКСА на МИКОПЛАЗМЫ - до клеток дело не дойдет

Kucha

Юбилейный

31.08.2007 22:21

URL #10

Здравствуйте гость! а почему мы будем тестить все перечисленное? спасибо за ссылку)

Alexey Lomakin

Boston, MA

03.09.2007 01:19

URL #11

To Kucha:

Тестировала наша постдочка клетки на микоплазму ПЦРом (не знаю, не биг фан ПЦРных игр, по-моему, она юзала какой-то коммерчески эвейлэбэл кит, базирующийся на ПЦР). Всё было чистенько.
Я тупо-вяло красил клетки на нужные мне антигены, ну и один раз ДАПИ докрасил. Картинка получилась жуткая: все в микоплазме. Мне никто не поверил, мол ПЦР не перешибешь! Проверили повторно ПЦРом - и правда микоплазма, ясно?

Так что не заморачивайтесь с ПЦРами, праймерами, внутренними контролями и т.д. и т.п. ДАПИ покрасить, в микроскоп глянуть - и то-та дело рОдное

Поблагодарили (1): Atropos

Qzak
Постоянный участник

03.09.2007 07:33

URL #12

если применяя ДАПИ+микроскоп вы не увидели там микоплазмы, она там еще очень даже может быть. При ПЦР со всеми контролями вероятность проглядеть ее меньше

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

03.09.2007 09:56

URL #13

(Alexey Lomakin @ 03.09.2007 01:19)

Не согласен! Это не типичный случай.

Проблема всегда в обратном - ПЦР (особенно самопалные киты "по статьям") обнаруживает микоплазму везде, даже в воде. Главная причина этого - неспецифические праймеры, дающие перекрестные реакции со многими 16S, в том числе E.coli.

comp3v
Постоянный участник
Москва

03.09.2007 11:34

URL #14

(Ъ @ 03.09.2007 08:56)

Не согласен! Это не типичный случай.

ну так это недостаток конкретных праймеров, а не метода. Мы периодически проверяем клетки (покупной системой), и в отр.контроле всегда всё чисто (а полоска внутреннего контроля даёт уверенность в нормальном прохождении реакции).

Kucha

Юбилейный

04.09.2007 18:59

URL #15

Спасибо всем...

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

04.09.2007 19:16

URL #16

(Kucha @ 04.09.2007 18:59)

Спасибо всем...

Не изобретайте велосипед, Анна! Для начала покупайте готовый и катайтесь на здоровье.

Guest
IP-штамп: frrS5cykybS16
гость

04.09.2007 23:56

URL #17

(Ъ @ 04.09.2007 19:16)

Не изобретайте велосипед, Анна! Для начала покупайте готовый и катайтесь на здоровье.

а дапи надежней

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

05.09.2007 17:51

URL #18

(Alexey Lomakin @ 03.09.2007 01:19)

То Куча:

Тестировала наша постдочка клетки на микоплазму ПЦРом (не знаю, не биг фан ПЦРных игр, по-моему, она юзала какой-то коммерчески эвейлэбэл кит, базирующийся на ПЦР). Всё было чистенько.
Я тупо-вяло красил клетки на нужные мне антигены, ну и один раз ДАПИ докрасил. Картинка получилась жуткая: все в микоплазме. Мне никто не поверил, мол ПЦР не перешибешь! Проверили повторно ПЦРом - и правда микоплазма, ясно?

С ДАПИ трудно напортачить - а с ПЦРом нагородить и ложно-отрицательных
и ложно-положительных - без проблем - даже сильно старатся не надо

Makenna
IP-штамп: frYUDxQtTmM0s
гость

17.05.2022 22:37

URL #19

Makenna

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.