Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Shuriko Участник |
Как обычно, буду обращаться с детскими вопросами. Недавно перешла с дрожжей на клетки млекопитающих, осваиваю методики. Хотя очень многое прописано в протоколах, у меня пока нет никакого "чувства" клеток, и я не очень понимаю, сколько клеток высевать, сколько часов ждать, доросли клетки до нужной конфлюентности или еще нет, и так далее. Буду очень благодарна, если кто-нибудь не пожалеет времени и поделится опытом. Если вам вдруг захочется меня пнуть в ответ на дурацкие вопросы... ну пните, что делать. Сначала совсем простое: 1. Насколько клеткам плохо, если при ресуспендировании образуются пузыри? Наверное, этого желательно избегать? 2. Заметила, что при рассеве культуры, даже если покачать чашку, на следующий день клетки распределяются неравномерно - большая плотность в середине, меньшая по краям. Я так понимаю, это не очень хорошо, например, для трансфекции. И что, просто более тщательно перемешивать? 3. Действительно HeLa можно пассировать не более 20 раз? А что потом? Новая пробирка из азота? 4. Прочитала про развитие устойчивости к трипсину. На 100 мм чашку я добавляю от 1 до 2 мл трипсина. Это как - много? 5. От чего зависит выбор "сосуда" - чашки или flask (ох, как же это по-русски)? И по трансфекции. Использую липофектамин 2000, с 293F вроде получается нормально, но такое чувство, что пока просто везет. Да и линия в этом смысле самая легкая. Но вот дошло дело до HeLa. 1. Я использую 6-well dish. С учетом коэффициента по методике нужно взять 4*10х5 клеток per well. Я так понимаю, что столько клеток должно быть на момент трансфекции. Сколько клеток HeLa нормально высеять накануне трансфекции? 2*10х5, если считать время удвоения примерно 24 часа? Больше, меньше? Просто есть мнение, что лучше брать больше, чтобы сгладить результат токсичности липофектамина. 2. 4 мкг плазмидной ДНК нормально для такого количества клеток? 3. Или не париться и сделать reverse transfection? Существенна ли разница в эффективности? Мне надо потом на этих клетках смотреть локализацию GFP-меченого белка. Наверное, еще что-то важное забыла, ну да ладно. Огромное спасибо за помощь. |
petr Постоянный участник |
(Shuriko @ 17.09.2012 21:48) Доброго дня, коллеги. Как обычно, буду обращаться с детскими вопросами. Недавно перешла с дрожжей на клетки млекопитающих, осваиваю методики. Хотя очень многое прописано в протоколах, у меня пока нет никакого "чувства" клеток, и я не очень понимаю, сколько клеток высевать, сколько часов ждать, доросли клетки до нужной конфлюентности или еще нет, и так далее. Буду очень благодарна, если кто-нибудь не пожалеет времени и поделится опытом. Если вам вдруг захочется меня пнуть в ответ на дурацкие вопросы... ну пните, что делать. Сначала совсем простое: 1. Насколько клеткам плохо, если при ресуспендировании образуются пузыри? Наверное, этого желательно избегать? 2. Заметила, что при рассеве культуры, даже если покачать чашку, на следующий день клетки распределяются неравномерно - большая плотность в середине, меньшая по краям. Я так понимаю, это не очень хорошо, например, для трансфекции. И что, просто более тщательно перемешивать? 3. Действительно HeLa можно пассировать не более 20 раз? А что потом? Новая пробирка из азота? 4. Прочитала про развитие устойчивости к трипсину. На 100 мм чашку я добавляю от 1 до 2 мл трипсина. Это как - много? 5. От чего зависит выбор "сосуда" - чашки или flask (ох, как же это по-русски)? 1. Разницы никогда не замечал 2. Для трансфекции это не очень хорошо, надо лучше перемешивать и не давать плашке стоять в ламинаре, а сразу убирать в инкубатор. Имхо клетки собираются в середине в кучу из-за вибрации. Если они так постояли, то перед тем, как убирать в термостат надо потрясти еще раз. Трясти не круговыми движениями, а восьмеркой. 3. Нет. Хеля такая уже старая культура, что ей число пассажей фиолетово. Она даже в ATCC считается неидентифицируемой (это я о STR profiling). 4. перед тем как добавлять трипсин клетки надо промыть PBS-ом. 1-2мл трипсина - это нормально. С чашки клетки снимайте средой с сывороткой, тогда соплей не будет. 5. Как кому удобнее. Если клетки предполагается соскр***, то лучше чашка, и т.д. (Shuriko @ 17.09.2012 21:48) И по трансфекции. Использую липофектамин 2000, с 293F вроде получается нормально, но такое чувство, что пока просто везет. Да и линия в этом смысле самая легкая. Но вот дошло дело до HeLa. 1. Я использую 6-well dish. С учетом коэффициента по методике нужно взять 4*10х5 клеток per well. Я так понимаю, что столько клеток должно быть на момент трансфекции. Сколько клеток HeLa нормально высеять накануне трансфекции? 2*10х5, если считать время удвоения примерно 24 часа? Больше, меньше? Просто есть мнение, что лучше брать больше, чтобы сгладить результат токсичности липофектамина. 2. 4 мкг плазмидной ДНК нормально для такого количества клеток? 3. Или не париться и сделать reverse transfection? Существенна ли разница в эффективности? Мне надо потом на этих клетках смотреть локализацию GFP-меченого белка. Наверное, еще что-то важное забыла, ну да ладно. Огромное спасибо за помощь. 1. Липофектамин в помойку. Есть много других менее токсичных реагентов. Вот тут посмотрите Я предпочитаю конфлюентность около 70-80%. Посейте клетки в разведениях, Ваша Хеля может расти не так как наша, поэтому сколько клеток сажать не подскажу. 2. Многовато, но нормально. Можно и 2 мкг. Только это не на количество клеток, а на лунку и на количество трансф.реагента должно считаться. 3. Не пробовал. Если надо смотреть локализацию, то так сильно напрягаться по поводу эффективности трансфекции нет смысла (разве чтобы поучиться). Вам достаточно было бы и 10% трансфецированных клеток.
|
Shuriko Участник |
По поводу липофектамина - эк вы сурово Судя по форуму, многие пользуются и довольны. Но на будущее учту. Сообщение было отредактировано Shuriko - 18.09.2012 01:44 |
ship Постоянный участник Moscow |
Если прям вообще хотите все сделать хорошо - то просто посейте клетки в диапазоне от 100 000 до 400 000 на лунку и оцените конфуентность на след день, там где 70-80% - вот столько и сейте на трансфекцию потом. Собственно тоже самое можно сделать и количеством ДНК и реагента для трансфекции, все это титруется и смотрится сколько дает хорошую трансфекцию и при этом нетоксично. Если смотрите локализацию -то желательно чтобы клеток было не сильно много, ибо они не смогут нормально распластататься, и картинка будет хуже, да и картина локализации белка может отличаться в зависимости от пплотности посева
|
irinav15 |
Очень надо матрасик с культурой Hela, у кого есть разогнанная. Покупали в Панэко, пока везли до дома, до хаты - клетки при пересеве стали апоптозными и быстро сдохли (((( Мы не из Москвы, но могли бы с оказией подъехать, забрать, если договоримся. Заранее спасибо за помощь. |
vadimchik152a Постоянный участник |
|
Ufa1688 Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
vadimchik152a Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
shutdown IP-штамп: frAafNuYANUh2 гость |
get the attention of Tokyo and Washington. |
waqas IP-штамп: fr24zn4QqqQcw гость |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
clickhere Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
clickhere Постоянный участник |
|
clickhere Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
rajkumar |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
topseom1144 |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
topseom1144 |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
bqseo IP-штамп: frCTlEX/2mZLc гость |
|
Ok Bro Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |