Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Horse-radish Участник |
Необходимо образцы тотальной РНК (конечно же их мало и они очень ценны), содержащих геномку, "растянуть" на пару десятков постановок qPCR. Известная задача, для которой есть ряд решений известных вендоров с WTA китами. Подход выбрал следующий: поскольку, наряду с mRNA, нужно смотреть lncRNA, RT нужно будет ставить с рандомных праймеров. Следовательно целевую РНКу нужно чистить от геномки и rRNA (потери, потери...). Далее, используя кит для WTA, например от кайджина, лигировать и амплифицировать. Буду признателен советам и предложениям. Ну и главный момент - линейность амплификации. У кого имеется опыт работы с WTA, применительно для количественного анализа? Какие сдвиги по Ст ожидаемы для мало и высококопийных матриц? |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Тоже планирую с ними работать. Работал с Ф29 - до сих пор под впечатлением. Но с тех пор много воды утекло... |
ship Постоянный участник Moscow |
и зачем нужна wta? изза низкой копийности матриц? мРНК мы всегда с рандом праймерами смотрим, почему то из вашего текста вывод, что рандом праймеры нужны именно изза lncRNA. непонял почему. у Инвитроджена щас вышла новая модификация суперскрипт SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme 50 rxn, как раз для использования в случаях когда важно чтобы с геномки не ПЦРилось. Можно еще от ДНКазить на колонках RNeasy с ДНКазой от Qiagen. |
Horse-radish Участник |
(-Ъ- @ 14.04.2017 13:43) Лучшее из того, что человек придумал на эту тему: Тоже планирую с ними работать. Работал с Ф29 - до сих пор под впечатлением. Но с тех пор много воды утекло... Спасибо, ознакомлюсь. У кайджина в "REPLI-g WTA", так понимаю, используется Ф29, поэтому кДНКу предварительно лигируют. |
Horse-radish Участник |
(ship @ 14.04.2017 13:45) а почему вас обычная РТ-ПЦР не устраивает? вы пробовали ее? и зачем нужна wta? изза низкой копийности матриц? мРНК мы всегда с рандом праймерами смотрим, почему то из вашего текста вывод, что рандом праймеры нужны именно изза lncRNA. непонял почему. у Инвитроджена щас вышла новая модификация суперскрипт SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme 50 rxn, как раз для использования в случаях когда важно чтобы с геномки не ПЦРилось. Можно еще от ДНКазить на колонках RNeasy с ДНКазой от Qiagen. WTA нужно для проведения прогона N-го кол-ва пцр, что невозможно выполнить с тем количеством РНК что есть. Ваш вопрос по поводу праймирования мРНК связан с RT-qPCR или с whoe transcriptome cDNA synthesis? |
kb1 Участник |
|
kb1 Участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
(Horse-radish @ 14.04.2017 14:22) WTA нужно для проведения прогона N-го кол-ва пцр, что невозможно выполнить с тем количеством РНК что есть. Ваш вопрос по поводу праймирования мРНК связан с RT-qPCR или с whoe transcriptome cDNA synthesis? И с тем и с другим. Не совсем понял формулировку выбора рандом праймеров для вашей задачи. Звучит как будто " Взяли рандомы тк надо детектировать мРНК и lncRNA", а если бы не надо было lncNA, то взяли бы чтото другое. А взять можно либо ген-специфичные либо олиго дТ. Минимальное количество РНК на реакцию с суперскрипт IV - 10 пикограм по мануалу, не знаю сколько у вас, но если есть хотя бы 10-100 нг РНК, то я бы обычную РТ-ПЦР попробовал. Делов на 1 день. |
Horse-radish Участник |
(ship @ 14.04.2017 15:46) И с тем и с другим. Не совсем понял формулировку выбора рандом праймеров для вашей задачи. Звучит как будто " Взяли рандомы тк надо детектировать мРНК и lncRNA", а если бы не надо было lncNA, то взяли бы чтото другое. А взять можно либо ген-специфичные либо олиго дТ. Минимальное количество РНК на реакцию с суперскрипт IV - 10 пикограм по мануалу, не знаю сколько у вас, но если есть хотя бы 10-100 нг РНК, то я бы обычную РТ-ПЦР попробовал. Делов на 1 день. Не все lncRNA с полиА хвостом. Если требуется детектировать только мРНК, по инструкции логичнее использовать олигодТ. Какая бы крутая обратная транскриптаза не была, она мне не поднимет матрицу на 2-3 порядка. Еще раз повторю, на выходе должно быть достаточно материала для нескольких десятков (сотни) постановок кПЦР. |
ship Постоянный участник Moscow |
(Horse-radish @ 14.04.2017 16:16) Не все lncRNA с полиА хвостом. Если требуется детектировать только мРНК, по инструкции логичнее использовать олигодТ. Какая бы крутая обратная транскриптаза не была, она мне не поднимет матрицу на 2-3 порядка. Еще раз повторю, на выходе должно быть достаточно материала для нескольких десятков (сотни) постановок кПЦР. Ок, понял. Спасибо, если счет идет на сотни, то другое дело. |
criplenie Участник |
(Horse-radish @ 14.04.2017 16:21) Для qPCR - не нужно. |
kb1 Участник |
(-Ъ- @ 14.04.2017 16:43) Лучшее из того, что человек придумал на эту тему: Тоже планирую с ними работать. Работал с Ф29 - до сих пор под впечатлением. Но с тех пор много воды утекло... Это не WTA, а WGA, но возможно будет полезно (из новенького так сказать)
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(kb1 @ 24.04.2017 18:28) Это не WTA, а WGA, но возможно будет полезно (из новенького так сказать) Первый метод можно испытать хоть сейчас. Только я не помню SD обладает экзо- активностями. А если к ней домен (phusion) присобачить? Сообщение было отредактировано -Ъ- - 25.04.2017 11:47 |
R-J-Dio Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |