molbiol.ru -> Оптимизация эффективности real-time PCR

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Оптимизация эффективности real-time PCR

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

Nameless
Постоянный участник
CA

31.01.2008 20:12

URL #1

У меня тут проблема, из которой не могу найти выхода. Ситуация такая: есть семейство белков, гены которых высоко гомологичны. Мне нужно с помощью real-time посмотреть изменения их экспрессии при определённых условиях. Я подобрал пары праймеров для каждого и них. В каждом случае праймеры получились на 50-70% гомологичные к другим генам внутри семейства, лучше сделать никак не получается, максимум что получилось - в каждом случае сделать на 3' конце 5-6 уникальных нуклеотидов. Короче, праймеры менять я не могу, потому и эти получилось найти с большим трудом.

Использую SYBRGREEN от AВР MJ MINI от биорада, в реакцию беру 400 µМ каждого праймера.
Программа:
95С-10мин (требование кита)
95С-15с
60С-15с
72С-30с
75С-5с
plate read
кривая плавления 60-90С, шаг 0.5С/3c

Вот, праймеры пришли, я проверил кривые плавления - всё идеально, один острый пик в каждом случае, димеров нет, размер продукта на геле соответствует (все ампликоны в районе 90-130 bp). Дальше сделал разведение кДНК из RT реакции анализируемой матрицы (585, 280, 120, 42, 15 ng в ПЦР) в условиях когда все гены более-менее нормально экспресируются, и прогнал пару раз с каждой парой. Естествено, поставив сначала минус-РТ и убедившись, что ДНК- загрязнений в РНК нет. Точки лежат в линии хорошо, r^2 0.97-0.99. И дело в том, что по стандартной кривой максимум эффективности, что я получаю - 60-70% практически для всех праймеров. Выход продукта по кривой поглощения у разных праймеров разный и не коррелирует с эффективностью.

Сразу оговорюсь: для одного из генов эффективность была 89%, ещё для одного 125%, с теми же реактивами и пластиком.

Пока что пробовал увеличивать магний. Пробовал с двумя генами с увеличением MgCl2 от 0.5 до 3 мМ, в обоих случаях почему-то реакция ингибируется с увеличением концентрации магния.

Сейчас ещё попробую прогнать кривые разведения с разной температурой отжига, но сомневаюсь что это поможет в плане эффективности, так как праймеры будут отжигаться более специфично, но менее эффективно и выход продукта упадёт. А больше пока идей нет. Менять концентрацию праймеров и мерить стандартной кривой - по-моему, бред, потому что одна и та же концентрация для каждой точки кривой будет по своему оптимальной, а эффективность измеряется по всей кривой. С матрицей играться тоже не могу - в чём тогда смысл кривой разведений? Короче, пока наступил кризис жанра.

То есть у меня вопрос: есть ли надёжный способ увеличить эффективность реакции с конкретной парой праймеров, и чтобы это потом можно было померить с помощью кривой разведения? Может быть, кто-то сталкивался с такой проблемой?

Сообщение было отредактировано Nameless - 31.01.2008 20:35

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

31.01.2008 20:29

URL #2

Мне кажется причина в том. что не учитываете влияние компонентов РТ смеси, особливо Ревертазы, на ПЦР:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlere...i?artid=1298932
Попробуйте сначала на чистой ДНК (плазмиде).

Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость

31.01.2008 20:30

URL #3

(Nameless @ 31.01.2008 19:12)

Пока что пробовал увеличивать магний. Пробовал с двумя генами с увеличением MgCl2 от 0.5 до 3 мМ, в обоих случаях почему-то реакция ингибируется с увеличением концентрации магния.

Did you try to take less Mg?

2 most common reasons for low PCR efficiency:

1. Poor primer annealing, which is solved by increasing Mg/primer concentrations and/or lowering annealing temperature

2. Poor amplicon denatration, which is solved by decreasing Mg/increasing denaturatuin step time/temperature

Nameless
Постоянный участник
CA

31.01.2008 20:40

URL #4

>Ъ
Но с продуктами той же РТ реакции я получаю и 60%, и 130%

>YuriK
Магний понизить не могу, потому что он в супермиксе. Вот отжиг сейчас попробую. Насчёт концентрации праймеров, то есть скорее соотношения кол-ва праймеров к матрице это, конечно, правильно, но по-моему это некорректно для кривой разведения.

Ъ
IP-штамп: frNwv0U1khjS.
гость

31.01.2008 20:54

URL #5

(Nameless @ 31.01.2008 19:40)

Если эти 60 и 130% воспроизводится железно, тогда другое дело. Что значит "нг в ПЦР" - какой объем РТ вносите в ПЦР?. Остальные реактивы от какой фирмы?

Nameless
Постоянный участник
CA

31.01.2008 21:18

URL #6

Реакция 20µl, матрицы вношу в каждом случае 1µl из готовых разведений (585>>15ng/µl) в той же воде.
Power SybrGreen PCR mastermix - Applied Biosystems, nucl.free вода - Quiagen, праймеры - Operon.

Сообщение было отредактировано Nameless - 31.01.2008 21:22

Nameless
Постоянный участник
CA

31.01.2008 23:39

URL #7

Оптимизация температуры отжига не помогла - пробовал температуры от 55 до 65 с шагом в градус - эффективность от 63% увеличилась до 68%.
В смысле 63% было в первом подходе при 55С, максимум достигнутый при оптимизации - 68% при 61С

Сообщение было отредактировано Nameless - 01.02.2008 00:07

Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость

31.01.2008 23:50

URL #8

(Nameless @ 31.01.2008 22:39)

Оптимизация температуры отжига не помогла - пробовал температуры от 55 до 65 с шагом в градус - эффективность от 63% увеличилась до 68%.

I don't know how much SYBR green they put in but it is an inhibitor of PCR and can slow it down. Try EvaGreen instead, or adding less SYBR ( ie, diluting the SYBR(+) SMix with SYBR(-) SMix)

Nameless
Постоянный участник
CA

31.01.2008 23:59

URL #9

Сибр в ките и я не могу его варьировать. С евойгрин тоже зводиться не буду - это ещё месяц всё оптимизировать под новый кит. Навряд ли причина в этом, потому что при том же кол-ве сибра в реакции я получаю разные эффективности. если бы он ингибировал, то везде одинаково..

Yuri K
IP-штамп: frbSxBL61s/9I
гость

01.02.2008 01:31

URL #10

(Nameless @ 31.01.2008 22:59)

если бы он ингибировал, то везде одинаково..

Not necessary true, but I ran out of ideas anyway. Except maybe you can try another kit lot or a different kit make altogether.

Derro
Постоянный участник

01.02.2008 11:20

URL #11

Простите, а какая необходимость увеличивать эффективность? Просто учитывайте ее при расчетах. Или я что-то не правлино понял? Так или иначе, но если при тех-же ферментах и др компонентах реакции вы можете наблюдать большую эффективность, то дело здесь в праймерах. А если при разных температурах они показывают практически равную эффективность, тут уже ничего не сделаешь...

Derro
Постоянный участник

01.02.2008 11:21

URL #12

Или попробуйте убрать стадию элонгации (совместите ее с отжигом). Может помочь...

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

01.02.2008 12:19

URL #13

(Nameless @ 31.01.2008 22:59)

Ева Браун - это не кит, а водный раствор димера акридиноранжа

добавляю в 2Х ФастМикс АБИ и гоняю на Степане двухтемпературные 95-64 реакции . В вашем ките АмплиТакГолд которую нужно ТОЧНО держать
при 95 смеси для ПОЛной активации - 94 или 96 не проходит
но это скорее скажется разбросом по блоку на миниоптиконе

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

01.02.2008 12:28

URL #14

(Nameless @ 31.01.2008 20:18)

Реакция 20µл, матрицы вношу в каждом случае 1µл из готовых разведений (585>>15нг/µл) в той же воде.
Пощер СыбрГреен ПЦР мастермих - Апплиед Биосыстемс, нуцл.фрее вода - Яуиаген, праймеры - Оперон.

попробуйте 40-60 сек на 72

f1dark
Постоянный участник
Lahore, Punjab, Pakistan

30.09.2022 14:40

URL #15

f1dark
Постоянный участник
Lahore, Punjab, Pakistan

30.09.2022 14:40

URL #16

Ufa1688
Постоянный участник

06.10.2022 16:30

URL #17

The DPRK is watching ufabet เข้า สู่ระบบ the US posing a serious threat ufa1688auto to the stability of the situation ufabet on the Korean peninsula ufa1688 and in its vicinity by redeploying UFA1688 the carrier task force in the ราคาบอล waters off the Korean สล็อตออนไลน์ peninsula,” read a statement from ลิงค์รับทรัพย์ the North Korean Foreign Ministry แฮนดิแคป posted on the state-run Korean บอลสเต็บ Central News Agency.

Ufa1688
Постоянный участник

14.03.2023 09:55

URL #18

Nunes da Silva’s app aff1688 experience with the police nigoal123 may point to a wider issue 123goal Metropolitan Police data shows ปั่นสล็อต that between 2010 and 2021เกมสล็อต only two police officers out of a total สูตรสล็อต of 573 accused were charged ทาง เข้า ufabet with rape or sexual ufabet vip assault after a public ทาง เข้า ufabet มือ ถือ complaint was brought แฮนดิแคป คือ against them.

Abu Road Escorts
IP-штамп: frQrtJ1xVpdzY
гость

16.03.2023 07:25

URL #19

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.