Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Как валидировать очистку от ДНК рекомбинантного белка -- Удалить ДНК и подтвердить чистоту --
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 09.07.2018 19:22     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Добрый день всем!
Стоит задаяа - очистить рекомбинантный белок с His-tag от урезанных форм и агрегатов на силикогельевой колонке для HPLC с фенильной прививкой в градиенте 2M (NH3)2SO4, подкисленный 0.1% трифторуксусной кислотой / бидистилированная H2O . Белок и его урезанные формы и агрегаты предварительно получены солюбилизацией телец включения и очисткой на Ni-NTA агарозе (элюция имидазолом). Эксклюзивную хроматографию использовать нельзя, так как образца очень мало - он используется под иммунизацию мышей для гибридом. Образец находится в буфере с сахарозой (выпадает в осадок без сахарозы или глицерина при замораживании). Очищать получается, но в системе присутствует ДНК. ДНК фрагментировали ультразвуком, затем обрабатывали ДНК-азой. Но что-то осталось. Фенилка имеет слабый положительный заряд, снять ДНК с нее получалось в солевом буфере, блокирующем отрицательный заряд фосфатов, с градиентом. Колонка не убилась так как использовал предколонку. По спектру на 254 нм было ясно видно что идет ДНК. (Прибор Agilent 1100).
Что лучше делать:
1. Обработать ультразвуком, затем ДНКазой.
2. Осадить полиэтиленимином
3. Осадить + заряженным хроматографическим сорбентом (Q-сефароза, DEAE)
Пробовал методы 1 и 3. ДНКаза работет не полностью, возможно надо диализировать в буфер, в котором она работет лучше. Один ультразвук не вариант - он только фрагментирует ДНК, а не удаляет. при выполнении метода 3 белок связывется с сорбентом сильнее чем ДНК. Методом 2 не решил воспользоваться так как остаток полиэтиленимина может намертво сесть на фенилку.
4. Может как-то использовать центрипреп?
Как валидировать очистку?
Пробовал при помощи спектрофотометра как 254 нм так и сканировать спектр 200 - 300 нм. Но что-то выглядит неубедительно. Кстати, взаимодействуя с белком ДНК меняет спектр поглощения. Но это не главное.
Буду благодарен за любую помощь.

Сообщение было отредактировано KCN - 09.07.2018 19:23
Участник оффлайн! Panaev
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.07.2018 13:54     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Не очень понял вопрос.
Валидируют обычно уже разработанный процесс, а вы не знаете, как от ДНК очиститься. Да еще и процесс далек даже от экспериментального уровня производства. Что там валидировать?
Вам таки разработать или валидировать?
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 10.07.2018 15:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

И то и другое. А валидируют при помощи PCR, где то так: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28426392

Так же это изложено в USP, BP, EP.

Есть порог чувствительности метода, но даже если ПЦР не обнаруживает копий вектора, они все равно там присутствуют в подпороговом количистве. Более того, при промышленной очистке от ДНК, целые молекулы ДНК попадают в конечную фракцию белка. Поэтому, они будут медленно, но уверенно забивать колонку, особенно если колонка минипреапаративная, годная для аналитики. Логично, что без предколонки работать нельзя.
Или надо подбирать сорбент и буфер, чтобы высадить ДНК на самонабивной колонке на FPLC.

Сообщение было отредактировано KCN - 11.07.2018 05:54
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 10.07.2018 19:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Боже ж ты мой....
ну допустим, аббревиатуру rt-pcr даже в урюпинске применяют в смысле пцр с обратной транскрибцией. Обычно пишут qPCR.
ну допустим, вам еще и сам медод контроля нужно будет валидировать. А валидировать пцр доя контроля остаточной днк нетривиальная задача. Так как в отличие от ваших представлений у пцр чувствительность сильно выше критерия приемлемости. Сколько у вас там критерий приемлемости? 10 нг/доза или 5?
ну допустим, есть и другие suitable methods.
ну допустим, не надо так гордо размахивать юэспи и бипи. В родной гф 13 это тоже есть.
Ну и вершина - промышленная колонка минипрепаративная, годная для аналитики! Я это даже запишу где-нибудь. Вы точно понимаете, чем занимаетесь?
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 11.07.2018 06:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Так и пугайте в Урюпинске своей PCR пьяных медведей, в обнимку с ГФ13. У нас в Украине ваша ГФ13 является просто макулатурой, пригодной для того, чтобы заворачивать в нее сало. Так как не гармонизирована с EP и BP, частично с USP, в то время как ДФУ - большей частью гармонизирована, за исключением N - статей (Nationality).
Что касается минипрепаративной колонки - то вы когда-либо слышали, что такое масштабирование? Или низкие температуры тундры российской необъятной паталогически влияют на уши?

Запишите себе, и обязательно добавте к тому, что для очистки белка для иммунизации животных ПРОМЫШЛЕННАЯ колонка НЕ требуется, поскольку в промышленных масштабах животных НЕ иммунизируют. Из них получают гибридомы, из которых потом чистят антитела, вот там уже и используют промышленные колонки. Для очистки белка для иммунизации нужны какие-то микрограммы, но желательно, очень чистого белка, без агрегатов, урезанных форм и белков клеток хозяина.

Более того, в данной ситуации важна очистка белка от ДНК чтобы не убить колонку, а не из-за потенциально онкогенных эффектов на организм - мышек не жалко, у них и так иммунные клетки нужной специфичности появляются, даже если в белке будет ДНК.

"Вы точно понимаете, чем занимаетесь?"
- более чем вы себе представляете, в условиях весьма скудных ресурсов и оборудования.

Сообщение было отредактировано KCN - 11.07.2018 14:59
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 11.07.2018 08:45     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Кстати, аббревиатура RT-PCR может обозначать два разных метода Real Time PCR и Reverse transcription PCR. Использовать обозначение qPCR (quantitative PCR) более корректно. Я имел ввиду Real Time PCR.
Reverse transcription PCR может выполняться и в обычном циклере, без детекции, с последующим разделением продуктов в агарозном геле. Это полуколичественный метод в такой постновке. Так что не всегда reverse transcription PCR = qPCR.

Сообщение было отредактировано KCN - 11.07.2018 08:53
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 11.07.2018 10:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Кстати, микрограммы белка может даже лучше чистить на фенилке 250x4.7 мм, самой "толстой" из аналитических, так как на минипрепаративной он может выйти размытым - ведь его очень мало. Если бы белка было больше - я бы прогнал его через FPLC, используя гельфильтрационный сорбент.

Я уже чистил этот белок на HPLC, условия подобраны, но пришлось промывать предколнку отдельно , чтобы снять ДНК буфером с солью, экранирующей негативные заряды фосфатов.

ДНК приводит к существенному возрастанию давления , а когда сходит с сорбента, дает пик на 254 нм. И это после ультразвука и ДНК-азы EN 0521 DNA-se I Fermentas. Но больше эту эквилибристику делать как-то неохота.

Сообщение было отредактировано KCN - 11.07.2018 10:03
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 11.07.2018 21:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

(KCN @ 11.07.2018 04:02)
Ссылка на исходное сообщение  Так и пугайте в Урюпинске своей PCR пьяных медведей, в обнимку с ГФ13. У нас в Украине ваша ГФ13 является просто макулатурой, пригодной для того, чтобы заворачивать в нее сало. Так как не гармонизирована с EP и BP, частично с USP, в то время как ДФУ - большей частью гармонизирована, за исключением N - статей (Nationality).
Что касается минипрепаративной колонки - то вы когда-либо слышали, что такое масштабирование?  Или низкие температуры тундры российской необъятной паталогически влияют на уши?

Запишите себе, и обязательно добавте к тому, что для очистки белка для иммунизации животных ПРОМЫШЛЕННАЯ колонка НЕ требуется, поскольку в промышленных масштабах животных НЕ иммунизируют. Из них получают гибридомы, из которых потом чистят антитела, вот там уже и используют промышленные колонки. Для очистки белка для иммунизации нужны какие-то микрограммы, но желательно, очень чистого белка, без агрегатов, урезанных форм и белков клеток хозяина.

Более того, в данной ситуации важна очистка белка от ДНК чтобы не убить колонку, а не из-за потенциально онкогенных эффектов на организм - мышек не жалко, у них и так  иммунные клетки нужной специфичности появляются, даже если в белке будет ДНК.

"Вы точно понимаете, чем занимаетесь?"
- более чем вы себе представляете, в условиях весьма скудных ресурсов и оборудования.

Продолжайте заворачивать сало.
про промышленную хроматографию на аналитической колонке не я написал.

Впрочем, по теме сабжа - зачем вам в вашей кустарщине валидация? Ну почистили микрограммы, ну вкололи для получения гибридом. Валидация-то тут причем? Или слово красивое? Забудьте. Подберите условия очистаи на анионообменнике и работайте себе с миром на своей украине.
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 12.07.2018 07:57     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Видимо, термин "валидация" и вас не оставляет равнодушным, так как действует как красная тряпка на быка ;-)

Что касается вашей ГФ13, до того как защитить диссертацию, я работал на фармкорпорации. И как ни странно, регистрировал в Украине субстанции - рекомбинантные белки in bulk, производимые одной небезизвестной фирмой из России, называть ее я не буду. Так как я был инженером-технологом в R&D, то моя часть была модуль 3 CTD, качество. Там была жуткая несходимость по всем параметрам с ведущими фармакопеями мира, не говорю уже о нашей ДФУ. Практически по всем испытаниям. Ваша ГФ является прямым потомком фармакопеи СССР, и она настолько уклонилась в своем развитии от мировых фармакопей, что начала создавать трудности для выхода ваших фармкомпаний на мировой рынок. Российское АНД не подошло. Пришлось писать свое АНД на контроль качества субстанции, уже согласно требованиям ЕР и ДФУ. Но вашу валидацию техпроцесса мы подтвердить не смогли. И валидировать аналитические методики - это тоже обязаность инженера технолога R&D, и геморрой с этим был еще тот. Тем не менее, российский продукт был качественный и испытания выдержал. Но это уже оффтопик.

Что касается ионообменников, то они связывают белок сильнее, чем ДНК. Уже проверил.
Спиртом высаждать тоже не вариант, но попробовать можно. Можно попробовать и высолить сульфатом аммония. Для "человеческого употребления" сульфат аммония в биотехнологии запрещен, по крайней мере у нас в Украине. Но мышкам колоть после него белок можно.

Но контролировать наличие ДНК все таки надо, чтобы не убить колонку. ПЦР и праймеров у меня нету, надо попробовать СФ. Есть какая-то формула, когда-то видел, в Скоупсе, в "Методах выделения белка", есть формула, подставляя значения поглощения на СФ на волнах 254 и 280 нм можно вычислить количество ДНК и степень связывания с белком. Надо найти и попробовать.
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.07.2018 08:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(KCN @ 12.07.2018 05:57)
Ссылка на исходное сообщение  Видимо, термин "валидация" и вас не оставляет равнодушным, так как действует как красная тряпка на быка ;-)

Что касается вашей ГФ13, до того как защитить диссертацию, я работал на фармкорпорации. И как ни странно, регистрировал в Украине субстанции - рекомбинантные белки in bulk, производимые одной небезизвестной фирмой из России, называть ее я не буду. Так как я был инженером-технологом в R&D, то моя часть была модуль 3 CTD, качество.  Там была жуткая несходимость по всем параметрам с ведущими фармакопеями мира, не говорю уже о нашей ДФУ. Практически по всем испытаниям. Ваша ГФ является прямым потомком фармакопеи СССР, и она настолько уклонилась в своем развитии от мировых фармакопей, что начала создавать трудности для выхода ваших фармкомпаний на мировой рынок. Российское АНД не подошло. Пришлось писать свое АНД на контроль качества субстанции, уже согласно требованиям ЕР и ДФУ. Но вашу валидацию техпроцесса мы подтвердить не смогли. И валидировать аналитические методики - это тоже обязаность инженера технолога R&D, и геморрой с этим был еще тот. Тем не менее, российский продукт был качественный и испытания выдержал. Но это уже оффтопик.

Что касается ионообменников, то они связывают белок сильнее, чем ДНК. Уже проверил.
Спиртом высаждать тоже не вариант, но попробовать можно. Можно попробовать и высолить сульфатом аммония. Для "человеческого употребления" сульфат аммония в биотехнологии запрещен, по крайней мере у нас в Украине. Но мышкам колоть после него белок можно.

Но контролировать наличие ДНК все таки надо, чтобы не убить колонку. ПЦР и праймеров у меня нету, надо попробовать СФ. Есть какая-то формула, когда-то видел, в Скоупсе, в "Методах выделения белка", есть формула, подставляя значения поглощения на СФ на волнах 254 и 280 нм можно вычислить количество ДНК и степень связывания с белком. Надо найти и попробовать.


Как много слов ниочем. Попробуйте сокращать свою речь до смысла. И постарайтесь хотя бы на людях не демонстрировать клиническую русофобию. Это так же неприлично, как мастурбировать публично.
вы еще дипломы виалека какогонибудь тут выставите, чтобы все убедились, какой вы молодец. Ваши тексты говорят мне гораздо больше, чем ваше сиви.

слово "валидация" на меня никак не действует. Осмелюсь напомнить выдающемуся специалисту, что это слово ключевое в его же вопросе. Я то тут причем, что вы, видимо, пишите одно, а подразумеваете другое? Я мыслей читать не умею - спрошено про валидацию, отвечаю про валидацию.
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 12.07.2018 15:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Сначала уберите свои войска с окупированных территорий, а потом поговорим о русофобии. Лично я люблю творчество Пушкина, но не правительство Путлера и беснующуюся "вату".

Мысль в принципе одна: ваше ГФ такое унылое Г, что вы сами загоняете себя в рыночную изоляцию, без возможности выхода на мировые рынки. Хотя вам не привыкать. Впрочим, у вас все скатывается в унылое Г, потому как и все в вашей стране делается через Ж.

Если вы исходите желчью от зависти, видя что человек вас в чем-то превосходит - вы всего лишь сознаете свое ничтожество, и брызжите на него словесным поносом как шимпанзе кидается какашками из клетки. Ну что еще можно ожидать от такого ТОЛСТОГО, но увы - унылого тролля, как вы. Выймите бревно из своего глаза, прежде чем замечать соринку в чюжом. Признайтесь для себя, то что если кто-то имеет больший жизненный опыт, навыки и знания - это просто действует как яд на ваше гипертрофированное честолюбие.

И кончайте холиварить, тема все таки об удалении из пробы ДНК, и подтверждении оного, а не в закидывании "извечно младшего брата хохла" отборными русскими какашками по методу шимпанзе.
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 12.07.2018 15:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Лично мне уже и так понятно, что валидировать очистку согласно фармакопейным требованиям невозможно. Ввиду отсутствия ПЦР-аппарата и реактивов. Тему можно закрывать.
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 12.07.2018 16:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

PS:
vb - а ник вам лучше поменять: Полиграф Полиграфович Шариков вам больше подойдет. И не занимайтесь никогда валидацией, ибо это слово вызывает у вас острый приступ ментального поноса. Вам больше подойдет очищать Москву от бродячих котов, валидация - точно не для вас :-)
И прошу, не перенапрягайтесь с ответами, потому что от умственного напряжения человеческий гипофиз может ненароком отцепиться от "ватного" мозга, и тогда вы будете гавкать не на коллег на форуме, а снова на четырех лапах - на котов в подворотнях. :-)

Щиро зичу довгих років! Надобраніч, спіть сухенькі! :-)

Сообщение было отредактировано KCN - 12.07.2018 16:40
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 12.07.2018 21:11     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

(KCN @ 12.07.2018 13:30)
Ссылка на исходное сообщение  Сначала уберите свои войска с окупированных территорий, а потом поговорим о русофобии. Лично я люблю творчество Пушкина, но не правительство Путлера и беснующуюся "вату".

Мысль в принципе одна: ваше ГФ такое унылое Г,  что вы сами загоняете себя в рыночную изоляцию, без возможности выхода на мировые рынки. Хотя вам не привыкать. Впрочим, у вас все скатывается в унылое Г, потому как и все в вашей стране делается через Ж.

Если вы исходите желчью от зависти, видя что человек вас в чем-то превосходит - вы всего лишь сознаете свое ничтожество, и брызжите на него словесным поносом как шимпанзе кидается какашками из клетки. Ну что еще можно ожидать от такого ТОЛСТОГО, но увы - унылого тролля, как вы. Выймите бревно из своего глаза, прежде чем замечать соринку в чюжом. Признайтесь для себя, то что если кто-то имеет больший жизненный опыт, навыки и знания - это просто действует как яд на ваше гипертрофированное честолюбие.

И кончайте холиварить, тема все таки об удалении из пробы ДНК, и подтверждении оного, а не в закидывании "извечно младшего брата хохла"  отборными русскими какашками по методу шимпанзе.


Это просто прекрасно! То ли гф13 кончилась, то ли сало...
Видимо лично путин виноват в том, что вы не умеете чистить белки от днк и детектировать последнюю. Он же гад, не дает вам амплификатор. Эмбарго ввел. Бедные-бедные...

слушай, для укросрача здесь на форуме есть пара специальных тем. Я бы и те зарубил, но, видимо, они нужны для таких как вы, против природы не попрешь. Испражняйся там, а здесь подотри за собой.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): CowDoc
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 13.07.2018 05:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

Глубоко неуважаемый гражданин Шариков!

Тема была не про выделение белка, а про удаление ДНК и контроль оного.
Вынести контроль наличия ДНК в рекомбинантном белке на аутсорсинг за разумную плату не составило проблем. Так что поставленная задача решена.

Покупать циклер и реактивы к нему ради выполнения одной нерутинной задачи, возникающей раз в год - экономически НЕРЕНТАБЕЛЬНО.

Видимо, гипофиз все таки отцепился и вы продолжаете обгавкивать всех, кто разумнее и опытнее вас. Чтож, подтирать на форуме накиданые вами какашки - неблагодарное занятие, идите лучше гавкать на котов, они это оценят! ;-)

Сообщение было отредактировано KCN - 13.07.2018 06:45
Участник оффлайн! Bear
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 13.07.2018 14:57     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

Почитал ветку...

user posted image

На пустом месте...

Всего благодарностей: 3Поблагодарили (3): sceptique, CowDoc, LMP
Участник оффлайн! sceptique
Постоянный участник
временной жизни



 прочитанное сообщение 13.07.2018 15:33     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

Да тут модератор Аглая за порядком следит, потому можно и порусофобствовать. lol.gif

Особенно когда все методы вослед собственным мозгам зааутсорсили в гейропу. lol.gif

Сообщение было отредактировано sceptique - 13.07.2018 15:35
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 14.07.2018 17:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

Кстати, я из этой самой Европы и пишу. У нас теперь безвиз :-)
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 15.07.2018 10:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

(KCN @ 14.07.2018 15:32)
Ссылка на исходное сообщение  Кстати, я из этой самой Европы и пишу. У нас теперь безвиз  :-)

Абрикосы поспели? Украинских гастеров массово приглашают на уборку?
Участник оффлайн! LMP
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 16.07.2018 00:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

(KCN @ 14.07.2018 15:32)
Ссылка на исходное сообщение  Кстати, я из этой самой Европы и пишу. У нас теперь безвиз  :-)
А при чем тут безвиз, если вы там работаете? confused.gif
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 16.07.2018 10:23     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #21 множественное цитирование

Нет, я работаю в Украине. В Европе я на отдыхе.
Для этого надо билеты на поезд туда и обратно,
биометрический паспорт гражданина Украины,
денег около 400 евро (с учетом дороги) на 5-7 дней,
и хорошее настроение.
Желательно наличие банковской карты со счетом в евро.
Максимальный срок пребывания до 90 дней без визы, если я не ошибаюсь. Но так долго я там торчать не думаю.
Даже загранпаспорт не нужен - собрался и поехал, как в деревню к дедушке за вашими этими абрикосами tongue.gif
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 16.07.2018 10:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #22 множественное цитирование

Надеюсь что эта дурацкая и никому не нужная братоубийственная война скоро закончится и я смогу поехать и в Россию - с детства хочу посмотреть на Байкал. jump.gif
Сейчас посещения России, Крыма, Донбасса - нежелательны, потом начинаются всякие нежданчики и проблемы с органами...
НО ЭТО УЖЕ ЖЕСКИЙ ОФФТОПИК!
К теме, господа, к теме...
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 17.07.2018 11:51     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #23 множественное цитирование

В Львовском метрополитене украинские националисты опять избивают русских.
Иногда русских кидают прямо на рельсы перед поездом метро.
Подробнее тут: http://metro.lviv.ua/rus.html
Участник оффлайн! LMP
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 17.07.2018 21:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #24 множественное цитирование

(KCN @ 16.07.2018 08:34)
Ссылка на исходное сообщение  
К теме, господа, к теме...
логику товарисча опять не понял confused.gif последний пост - это что ли тема?

Сообщение было отредактировано LMP - 17.07.2018 21:54
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 18.07.2018 13:01     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #25 множественное цитирование

Не, это грубое отступление. Но я не удержался. Весь вечер смеялся над львовским сайтом.
Участник оффлайн! Bear
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 18.07.2018 13:04     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #26 множественное цитирование

(KCN @ 16.07.2018 11:34)
Ссылка на исходное сообщение  Надеюсь что эта дурацкая и никому не нужная братоубийственная война скоро закончится и я смогу поехать и в Россию - с детства хочу посмотреть на Байкал.  jump.gif
Сейчас посещения России, Крыма, Донбасса - нежелательны, потом начинаются всякие нежданчики и проблемы с органами...
НО ЭТО УЖЕ ЖЕСКИЙ ОФФТОПИК!
К теме, господа, к теме...


Извините, что встреваю, но это не какая-то там "никому не нужная братоубийственная война", а это ваша собственная гражданская война. И на Байкал вы можете ехать хоть завтра, если, правда, не участвовали в карательных операциях и не убивали мирное население на Донбассе.
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 18.07.2018 13:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #27 множественное цитирование

Кстати есть еще идея осадить интактную ДНК протаминами, например сальмином. А потом центрифугировать на максимальных g. Ионообменники я не пробую, так как рекомбинантный белок связывается с такими положительно заряженными сорбентами как Q-сефароза и DEAE.

Проверить , ушла ли ДНК из расствора рекомбинантного белка можно при помощи ПЦР на Т3-Т7 праймеры (или Т5 - там в зависимости от плазмиды, сиквенирующие праймеры) для плазмиды и праймерами на 16S рРНК гены - на геномную ДНК. Так пишут в литературе по поводу подтверждения удаления ДНК продуцента бактериального типа. Эти праймеры есть в продаже, уже готовые, поэтому к ним есть документация, что облегчает подтверждение качества.
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 18.07.2018 13:15     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #28 множественное цитирование

Срач по поводу войны - гражданская она или это интервенция - не стихает до сих пор.
Война выгодна ТОЛЬКО ОЛИГАРХАМ с обеих сторон - Потрох контролирует не только Рошен, фабрики которого продолжают работать в Липецке, но и военные заводы Украины. Шахтами, заводами, энергетикой, машино- и авиастроением страны владеют 5-6 человек. Им выгодно отправлять безработных людей, накачанных национальной идеей, на пушечное мясо, сливать туда технику и отмывать деньги. Россия так же сливает старую военную технику и лишние людские рессурсы в виде маргинальных элементов. А еще - Донбасс это полигон, где США и Россия испытывают не только старое, но и новое вооружение.
Простым людям вопросы языка, религии и вектора политики до одного места. И война им не нужна.

Я являлся активным участником майдана 2004 и 2014 года. В 2014 году на майдане я познакомился с Русинами из Правого Сектора. Они рассказали мне сценарий действия националистических сил и сепаратистов начиная с захвата сепаратистами Славянска и Краматорска и выходом из них на Донецк и действия украинских добробатов. В 2013 на территории ряда стран готовились ультраправые батальоны. Аналогично шла подготовка "ватных сил" на территории Юго-Востока. Мне даже назвали имена конкретных олигархов, стоявших за сценарием и финансировавших ту или инную силу. Тут я их приводить не буду. Сценарий , написанный еще в 2013 году, был полностью воспроизведен. Это ОЧЕНЬ сильно охладило мой пыл стремления к демократии. История развивается по спирали, и за фасадом демократии кроется тоталитарный феодализм. (Рей Бредбери, 451 градусов по фаренгейту)
Вы же не верите, что осьминоги могут предсказывать результаты чемпионата по футболу? Вам прекрасно понятно, что этих умных моллюсков дрессируют как собак Павлова. А результат матча известен ЗАРАНЕЕ - это договорняк. Все может капитал - ответит бритва Окама. Футбол я тоже не смотрю.

Поэтому ИМХО - в войне виноваты ОЛИГАРХИ. И никакая это ни гражданская война.

Крым-то вы у нас забрали, вот и приходится ездить отдыхать или в Европу или в Карпаты. lol.gif

Собственно, дописываю чтобы вы лучше понимали ситуацию в Украине. Поводом к моему участию в майдане 2014 было закрытие моей фирмы по торговле фармсубстанциями. Это был низкомаржевой бизнес с большими оборотами, и большим объемом разрешительной документации. Поборы требовали все - от пожарных до СБУ. У меня просто не хватало средств для этих всех выплат. Крыша у меня так же была, но она порешать все эти вопросы не смогла.

Что касается майдана 2004, то ВСЕ демонстрации в Украине, майданы, стачки, титушки - проплачены. Будучи студентом я на выходных умудрился постоять за Ющенко и за Януковича, меняя жилетки и флаги и получил оплату сразу с двух сторон. Так же я лично знаком с "сотниками" и "тысячниками", водившими людей. И с политтехнологом одного из наших экспрезидентов. Ввиду этих событий я стал более смотреть в сторону социализма по скандинавской модели. С частной собственностью и мелким бизнесом, семейным фермерством, государственной собственностью на землю и недра (с возможностью аренды) и рыночной гибридной экономикой.

По поводу фирмы и фармсубстанций - возьмите на заметку, может кто осилит в России. Очнь выгодно торговать вспомогательными веществами - их цены ниже на закупке. но потребности в них гораздо выше. Например лактозы моногидрат - ну трудно найти таблетки где его нету. Или тот же крохмалл картофельный, кукурузный и т.д.

Сообщение было отредактировано KCN - 19.07.2018 21:36
Участник оффлайн! Bear
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 18.07.2018 13:20     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #29 множественное цитирование

(KCN @ 18.07.2018 14:15)
Ссылка на исходное сообщение  Срач по поводу войны - гражданская она или это интервенция - не стихает до сих пор.


Я не знаю, где вы там и с кем срётесь - меня это не волнует.
Однако данная тема - это прекрасный индикатор на вменяемость.
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 18.07.2018 14:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #30 множественное цитирование

Давайте ее закроем - если бы не было заинтересованности капитала, то все могло бы сойти за гражданскую войну.

Лично я ни с кем не срусь - потому что живу в центре. И участвовал в карательных операциях разве что против форумных троллей, заклеивая им выхлопные отверстия. tongue.gif

За любой такой войной стоят финансовые интересы ОЧЕНЬ КРУПНЫХ людей и геополитика сверхдержав. Как это было во Вьетнаме, Афгане, Сирии и прочих локальных конфликтах.

Ни у Украины, ни тем более у Догнбасса НЕТ таких финансовых, людских, материальных, военных рессурсов, чтобы продолжать это противостояние в рамках гражданского конфликта. Кто-то БОГАТЫЙ и СТОРННИЙ постоянно льет воду на мельницу, или подливает масло в огонь - и с той и с другой стороны.

Давайте лучше о том, как ДНК бороздит просторы большого театра...
Участник оффлайн! LMP
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.07.2018 17:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #31 множественное цитирование

(KCN @ 18.07.2018 11:08)
Ссылка на исходное сообщение   Эти праймеры есть в продаже, уже готовые, поэтому к ним есть документация, что облегчает подтверждение качества.
праймеры то да есть, а вот уровень загрязнения ДНК они вам покажут или вам не актуально?
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 18.07.2018 22:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #32 множественное цитирование

(LMP @ 18.07.2018 18:36)
Ссылка на исходное сообщение  праймеры то да есть, а вот уровень загрязнения ДНК они вам покажут или вам не актуально?


Мне как раз и надо оценить количество геномной и векторной ДНК, которая загрязняет рекомбинантный белок. Загрязнение ДНК другими ДНК или РНК меня не интересует. Важен факт подтверждения избавления от ДНК при помощи УЗ и ДНК-азы. Я ж не ДНК чищу, а белок.
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 18.07.2018 23:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #33 множественное цитирование

(LMP @ 18.07.2018 18:36)
Ссылка на исходное сообщение  праймеры то да есть, а вот уровень загрязнения ДНК они вам покажут или вам не актуально?


Ваше сообщение натолкнуло меня на следующую мысль. Что если использовать процедуру очистки ДНК при помощи фенольного метода?
Можно ее использовать для очистки белка. Только водную фазу с ДНК/РНК откинуть, а фенольную с белком собрать.
Далее в фенол добавить петролейный эфир и гексан для снижения поверхностного натяжения и температуры кипения смеси.
Отогнать огранику при температуре +35С, чтобы не коагулировать белок.
Осадок белка расстворить в PBS рН 7.4 или TRIS HCl.
Отобрать пробу на ПЦР как из расстворенного очищенного белка так и из откинутой фракции ДНК в водной фазе.
Если в рекомбинантном белке нет ДНК, его можно наносить на колонку.
umnik.gif

Сообщение было отредактировано KCN - 18.07.2018 23:19
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 18.07.2018 23:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #34 множественное цитирование

Писец трешак. Можно еще в космос запустить.
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 19.07.2018 07:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #35 множественное цитирование

(vb @ 19.07.2018 00:29)
Ссылка на исходное сообщение  Писец трешак. Можно еще в космос запустить.


Можно наработать рекомбинантного белка, не ренатурируя, я поджарить его на сковородке lol.gif

Вот как котлеты из рибосом:
http://vpushkarev.narod.ru/doc/culinar.html

wink.gif
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 19.07.2018 07:35     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #36 множественное цитирование

По идее, после фенола с белком ничего плохого не случится, так как белок НЕ ренатурированный - он получен путем солюбилизации телец включений и очистки на Ni-NTA. Там хватает как урезанных форм так и внутримолекулярных и межмолекулярных агрегатов.

Для получения моноклонов на линейный эпитоп это не критично. Если надо детектировать пространственный эпитоп, например комплекс лиганд-рецептор , то лучше использовать поликлоны, полученные путем иммунизации мышей комплексом лиганд-рецептор. Это по нашим данным.
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 19.07.2018 07:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #37 множественное цитирование

Солюбилизировать тельца включения лучше в 8М мочевине. А вот так делать нельзя: http://bd.patent.su/2347000-2347999/pat/se...ervlet20cb.html в моем случае.

Triton и SDS и другие детергенты, используемые для солюбилизации телец включения, садяться на силикогель с фенильной прививкой, модифицируя поверхность сорбента. Отмыть от ионных детергентов колонку тяжело.
https://www.chemass.si/ca_content/Cleaning_...-18_columns.pdf

Хотя 1% SDS в виде инъекции можно вводить в случае намертво севших на колонку белков. Но лучше их отмывать градиентом ddH2O/ Acetonitrile 100%. [ Reversed-Phase Column Cleaning: SDS is OK, Vydac Advances, Grace/Vydac (The Separations Group (Hesperia, California, Winter 1998).]
http://phx.phenomenex.com/lib/gu54810610.pdf
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 19.07.2018 09:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #38 множественное цитирование

(KCN @ 19.07.2018 08:35)
Ссылка на исходное сообщение  По идее, после фенола с белком ничего плохого не случится, так как белок НЕ ренатурированный - он получен путем солюбилизации телец включений и очистки на Ni-NTA. Там хватает как урезанных форм так и внутримолекулярных и межмолекулярных агрегатов.

Для получения моноклонов на линейный эпитоп это не критично. Если надо детектировать пространственный эпитоп, например комплекс лиганд-рецептор , то лучше использовать поликлоны, полученные путем иммунизации мышей комплексом лиганд-рецептор. Это по нашим данным.



Собственно, с чего я начал огород городить, чтобы было понятно. Если иммунизировать животных смесью межмолекулярных и внутримолекулярных агрегатов, урезанных форм и нормального белка, получаются гибридомы, продуцирующие кросс-реактивные антитела. В итоге специфичность тестсистем на основе этих моноклонов серьезно падает, из-за перекрестных реакций с другими белками.
Участник оффлайн! vb
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.07.2018 20:36     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #39 множественное цитирование

(KCN @ 19.07.2018 07:55)
Ссылка на исходное сообщение  Собственно, с чего я начал огород городить, чтобы было понятно. Если иммунизировать животных смесью межмолекулярных и внутримолекулярных агрегатов, урезанных форм и нормального белка, получаются гибридомы, продуцирующие кросс-реактивные антитела. В итоге специфичность тестсистем на основе этих моноклонов серьезно падает, из-за перекрестных реакций с другими белками.

Ну это, если про селекцию клонов вам не рассказали в свое время.
Хотя, проблема вообще даже не в этом. Вся эта возня с днк - пустое.
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 19.07.2018 21:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #40 множественное цитирование

Я приеду, попробую удалить ДНК фенольным методом и ДНК-азой, отдам на ПЦР, сравню результаты а потом отпишусь.
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение 19.07.2018 21:42     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #41 множественное цитирование

(vb @ 19.07.2018 21:36)
Ссылка на исходное сообщение  Ну это, если про селекцию клонов вам не рассказали в свое время.
Хотя, проблема вообще даже не в этом. Вся эта возня с днк - пустое.


Персональноя я гибридомы не веду. Это делают дэвочки shuffle.gif
Селекцию клонов я проводил на фаговом дисплее для scFv - одноцепочечных миниантител, фаг М13. Делал библиотеки, ставил пенинг, отбирал клоны, анализировал. Руководство прикрыло эту тему ввиду сложностей ренатурации scFv - выход составлял 10-20%. И это были далеко не первые белки, которые мы ренатурировали. С другими было лучше.

Сообщение было отредактировано KCN - вчера, 06:00
Участник оффлайн! KCN
Участник



 прочитанное сообщение вчера, 14:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #42 множественное цитирование

Приехал. Решил опробовать фенольный метод. Вначале я решил выяснить, можно ли так работать с белком вообще без ДНК.
Для того чтобы не тратить рекомбинантный белок, потренировался на лизоциме из куринного яйца и на человеческом сывороточном альбумине.
Оба белка расстворил в буфере PBS pH 7.4, добавил фенольную фазу, размешал на vortex.
Собрал фенольную фазу, добавил гексан и петролейный эфир. Произвел отгонку.
Белок сформировал хлопьеорбразный осадок после отгонки органики.
Повторное расстворение в PBS произошло не полностью - белок плавал агрегатами,
хлопьями, появилась муть. Колоть такое в хроматограф - убить колонку.
В лучшем случае очитститься трипсином на ночь с последующим градиентом ddH2O / acetonitrile.
Такое поведение белка связано с тем, что формеруемый гидрофобными остатками кор белка разворачивается в огранических расстворителях и полностью денатурирует. При отгонке и переводе в водную фазу коровые гидрофобные аминоксилоты разных полипептидных цепей принадлежащих разным молекулам взаимодействуют между собой, вытесняя воду и образуют
межмолекулярные агрегаты, непригодные для хроматографирования и иммунизации животных.
Поэтому вопрос об анализе полноты удаления ДНК из такой системы отпал сам собой. Будем использовать УЗ и ДНК-азу.

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Биофизика и матметоды в биологии · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 21.07.18 11:07
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft