Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
tsagan Постоянный участник |
У нас есть прокариотический оперон, который синтезирует белок Х. Мы добились гиперэкспрессии этого белка (причем гены хромосомные, просто редуцировали часть генов с 5'-конца), предположение было, что изменилась промоторная область, так как по экспериментам экспрессия стала независимая от регуляторных генов. Секвенировали промотор, а он не изменился . Пока нет возможности сделать 5'-RACE. Если не изменился промотор, то как с него увеличилась экспрессия? |
Guest IP-штамп: fr5rCDKjN1xa6 гость |
(tsagan @ 25.03.2010 22:37) Дорогие коллеги, помогите разобраться. У нас есть прокариотический оперон, который синтезирует белок Х. Мы добились гиперэкспрессии этого белка (причем гены хромосомные, просто редуцировали часть генов с 5'-конца), предположение было, что изменилась промоторная область, так как по экспериментам экспрессия стала независимая от регуляторных генов. Секвенировали промотор, а он не изменился . Пока нет возможности сделать 5'-RACE. Если не изменился промотор, то как с него увеличилась экспрессия? Навскидку, может там в первом гене был аттенюатор. |
Esya Постоянный участник PA, USA |
Причин может быть много, включая и новые еще неизвестные. |
tsagan Постоянный участник |
Esya, не понял про "ехать и шашечки" |
dlinnosheee Постоянный участник |
Как и куда встраивали? |
VVolkov Постоянный участник |
|
tsagan Постоянный участник |
никуда не встраивали, редуцировали гены с 5'-конца. Про анекдот не знал, спасибо. Белок сам не интересен, изучен уже, а вот механизм выяснить очень интересно |
dlinnosheee Постоянный участник |
(tsagan @ 27.03.2010 00:50) значитъ там что-то было функциональное на 5'-конце. Как вариант в исходном штамме петля была типа такой: А вы отрезали один из сайтов связывания, вот в новом штамме петли и нет Сообщение было отредактировано dlinnosheee - 27.03.2010 17:46 |
Esya Постоянный участник PA, USA |
А для прочих умных спекуляций нужны подробности. |
dlinnosheee Постоянный участник |
(tsagan @ 25.03.2010 23:37) Тут уточнить надо бы от каких. Генов-то много в бедной прокариоте, и куда ни плюнь - все регуляторные Подозреваю, что в отрезанной вами ДНКе сидел либо ген либо сайт связывания того регуляторного белка от которого раньше зависело, а теперь не зависит. Сие предположение проверяется элементарным анализом последовательности отрезанной ДНКи. Сообщение было отредактировано dlinnosheee - 27.03.2010 01:21 |
tsagan Постоянный участник |
|
Esya Постоянный участник PA, USA |
Если вы это все знаете, то что вы на форуме ищите? Я хочу такое знание... Где берут такую программу...
|
petr Постоянный участник |
(tsagan @ 25.03.2010 20:37) Дорогие коллеги, помогите разобраться. У нас есть прокариотический оперон, который синтезирует белок Х. Мы добились гиперэкспрессии этого белка (причем гены хромосомные, просто редуцировали часть генов с 5'-конца), предположение было, что изменилась промоторная область, так как по экспериментам экспрессия стала независимая от регуляторных генов. Секвенировали промотор, а он не изменился . Пока нет возможности сделать 5'-RACE. Если не изменился промотор, то как с него увеличилась экспрессия? Я конечно плохо разбираюсь в прокариотической регулции транскрипции, но тем не менее. Вы как смотрели экспрессию? Вестерном или РеалТаймом? Собственно я к тому, что как Вы сделали вывод, что это увеличилась экспрессия, а не стабильность транскрипта или белка? |
petr Постоянный участник |
(tsagan @ 25.03.2010 20:37) Дорогие коллеги, помогите разобраться. У нас есть прокариотический оперон, который синтезирует белок Х. Мы добились гиперэкспрессии этого белка (причем гены хромосомные, просто редуцировали часть генов с 5'-конца), предположение было, что изменилась промоторная область, так как по экспериментам экспрессия стала независимая от регуляторных генов. Секвенировали промотор, а он не изменился . Пока нет возможности сделать 5'-RACE. Если не изменился промотор, то как с него увеличилась экспрессия? Присоединюсь к Есиным словам, что потихоньку начните редуцировать дальше, но так же интересно обратно потихоньку добавлять то, что было редуцированно. Еще можно пройтись по редуцированному региону (не знаю насколько он большой) делециями, т.е. нативный оперон в этом месте поделетировать. |
petr Постоянный участник |
(tsagan @ 25.03.2010 20:37) Дорогие коллеги, помогите разобраться. У нас есть прокариотический оперон, который синтезирует белок Х. Мы добились гиперэкспрессии этого белка (причем гены хромосомные, просто редуцировали часть генов с 5'-конца), предположение было, что изменилась промоторная область, так как по экспериментам экспрессия стала независимая от регуляторных генов. Секвенировали промотор, а он не изменился . Пока нет возможности сделать 5'-RACE. Если не изменился промотор, то как с него увеличилась экспрессия? Вообще схожая довольно история с моей. Правда у меня в первом интроне сидит регулятор. Отрезаешь, и экспрессия увеличивается как после стимуляции. |
tsagan Постоянный участник |
(Esya @ 27.03.2010 04:44) Мальчики (или девочки), вам известны все сайты всех регуляторных белков? Поделитесь мудростью Если вы это все знаете, то что вы на форуме ищите? Я хочу такое знание... Где берут такую программу... Мы знаем, что мы делетировали и никаких других сайтов связывания там нет, тем более что оперон регулируется только 1! белком. (petr @ 27.03.2010 04:53) Я конечно плохо разбираюсь в прокариотической регулции транскрипции, но тем не менее. Вы как смотрели экспрессию? Вестерном или РеалТаймом? Собственно я к тому, что как Вы сделали вывод, что это увеличилась экспрессия, а не стабильность транскрипта или белка? Экспрессию определяли ИФА и in vivo. В любом случае большое спасибо за советы и направления будущих экспериментов! |
dlinnosheee Постоянный участник |
(tsagan @ 27.03.2010 13:07) ну если вы знаете сайт связывания этого белка в промотерной области исходного штамме, то можете сделать выравнивание по той ДНК которую вы отрезали, и элементарно узнаете, отрезали ли вы потенциальные сайты связывания этого белкал. а по поводу того, что регулируется только одним белком - тут вы отметаете априори массу возможностей того, что сам этот белок в свою очередь кем-то регулируется, и вполне возможно что кем-то кого вы отрезали |
VVolkov Постоянный участник |
|
tsagan Постоянный участник |
(dlinnosheee @ 27.03.2010 13:32) ну если вы знаете сайт связывания этого белка в промотерной области исходного штамме, то можете сделать выравнивание по той ДНК которую вы отрезали, и элементарно узнаете, отрезали ли вы потенциальные сайты связывания этого белкал. а по поводу того, что регулируется только одним белком - тут вы отметаете априори массу возможностей того, что сам этот белок в свою очередь кем-то регулируется, и вполне возможно что кем-то кого вы отрезали Так в том то и дело, что сайты остались без изменений. Белок регулятор безусловно регулируется другими белками, но делеция этих генов не затрагивают, так они расположены на других участках хромосомы. (VVolkov @ 27.03.2010 14:26) tsagan - а Вы смотрели сайты связывания для всех белков данного организма? По протеомике пробивали? В соавторы включите за идею? Или просто шутите? Про изменение экспресии, конечно. протеомный анализ делали, там другие интересные данные были ) Сейчас займусь поиском возможных новых операторов в области прилегающей к 5'-сайту, хорошая идея. Спасибо. Могу выразить благодарность |
VVolkov Постоянный участник |
Если прокариот - то весь геном ведь известен, можно и связывание белков с DNA удаленной посмотреть. И белков немного в принципе-то. Это я так, очень оптимистически. |
dlinnosheee Постоянный участник |
(VVolkov @ 27.03.2010 15:36) Я и на благодарность согласен и оттиск статьи с аффтографом. Желательно на английском Хотя в соавторы лучше... а, вот откуда выплыл вопрос про авторское право Ну так в очередь после меня и Еси тогда Но ИМХО мотивация для давания советов на форуме немного другая |
VVolkov Постоянный участник |
Согласен и в очередь. Уже очень мне цифра в 1000! (тысячу!!! ) раз нравиЦЦа. |
tsagan Постоянный участник |
|
VVolkov Постоянный участник |
|
dlinnosheee Постоянный участник |
(tsagan @ 27.03.2010 15:24) Вы имеете в виду сайты в промотерной области, а я имею в виду дополнительные сайты для того же белка вне промотерной области. Посмотрите на картинку которую я выше пристегнул, там объясяется Сообщение было отредактировано dlinnosheee - 27.03.2010 17:51 |
tsagan Постоянный участник |
(dlinnosheee @ 27.03.2010 18:30) Вы имеете в виду сайты в промотерной области, а я имею в виду дополнительные сайты для того же белка вне промотерной области. Посмотрите на картинку которую я выше пристегнул, там объясяется Я не так понял Вас, вне промоторной области таких сайтов нет, там очень специфический регуляторный белок, под его контролем только два оперона, которые расположены в разных местах. |
petr Постоянный участник |
|
Esya Постоянный участник PA, USA |
(petr @ 27.03.2010 11:15) ага, или промотер |
petr Постоянный участник |
(Esya @ 27.03.2010 18:41) Не, серьезно пару раз такое получалось. Образовывался сайт для USF1 и для AP1 при мутагенезе или делеции (правда я опять про эукариоты). |
tsagan Постоянный участник |
|
dlinnosheee Постоянный участник |
(tsagan @ 25.03.2010 23:37) У нас есть прокариотический оперон, который синтезирует белок Х. Мы добились гиперэкспрессии этого белка (причем гены хромосомные, просто редуцировали часть генов с 5'-конца), предположение было, что изменилась промоторная область, так как по экспериментам экспрессия стала независимая от регуляторных генов. Вообще, если сигнал увеличился в 1000 раз и перестал зависеть от регуляторных белков, то есть смысл повторить на всякий случай эксперименты и контроль. И посмотреть внимательно экспериментальную процедуру чтобы убедиться, что редуцирование генов это единственное изменение которое вносится в систему. Еще неплохо бы знать тип исходного промотера (есть ли там UP-sequence например, и какова роль регуляторного белка, идет ли транскрипция без него в исходном штамме). |
dlinnosheee Постоянный участник |
(tsagan @ 27.03.2010 13:07) мРНК или белок? |
petr Постоянный участник |
(dlinnosheee @ 27.03.2010 20:22) ВОт именно, хорошо бы РеалТайм сделать |
gost' IP-штамп: frE1krxZbrc3w гость |
(dlinnosheee @ 27.03.2010 22:22) а как енто ИФА мРНК? париж не знал такого разврата) ну а ента загадачная фраза [in vivo] енто как??? Имха вот так великие закрытия и делаются. Исчо вопрос, что было в качестве контроля... |
dlinnosheee Постоянный участник |
(gost' @ 28.03.2010 01:20) "мРНК" это было не про ИФА а про неизвестный метод [in vivo]. На тему того, что изменение сигнала в 1000 раз и отсутствие зависимости от регуляторного белка - это больше похоже на регуляцию на другой стадии уже после инициации транскрипции. |
gost' IP-штамп: frE1krxZbrc3w гость |
|
Esya Постоянный участник PA, USA |
(dlinnosheee @ 27.03.2010 17:35) "мРНК" это было не про ИФА а про неизвестный метод [in vivo]. На тему того, что изменение сигнала в 1000 раз и отсутствие зависимости от регуляторного белка - это больше похоже на регуляцию на другой стадии уже после инициации транскрипции. Если не секрет, какая посттранскрипционная регуляция обеспечивает изменение сигнала в 1000 раз? На этом уровне же fine control чаще осуществляется... там эффект в 10 раз редкость. |
dlinnosheee Постоянный участник |
(Esya @ 28.03.2010 09:07) Если не секрет, какая посттранскрипционная регуляция обеспечивает изменение сигнала в 1000 раз? На этом уровне же fine control чаще осуществляется... там эффект в 10 раз редкость. Есть у меня на примете один постртранскрипционный механизм, но деталей тут недостаточно пока чтобы спекулировать. Во-первых, не отработаны предположения которые уже были высказаны выше, а во-вторых вполне может статься что эффекта на самом деле вообще нет. Если ген не экспрессировался в исходном штамме (был допустим некий шум который автор принял за сигнал), то как можно сказать про увеличение в 1000 раз? С таким же успехом можно было сказать про увеличение по сравнению с нулем в 10 раз и в 1000000 раз. А если ген стабильно экспрессировался в исходном штамме, а потом при тех же условиях стал экспрессироваться еще в 1000 раз больше да еще и перестал зависеть от того единственного белка который связывается с промотерной областью, то это очень большое изменение и его трудно объяснить на уровне инициации транскрипции. Сообщение было отредактировано dlinnosheee - 28.03.2010 12:24 |
dlinnosheee Постоянный участник |
(gost' @ 28.03.2010 04:52) Типа такого? В названии слова "ин виво" нет конечно |
tsagan Постоянный участник |
dlinnosheee, а можно про "один постртранскрипционный механизм" поподробнее? |
gost' IP-штамп: frE1krxZbrc3w гость |
(tsagan @ 28.03.2010 15:08) РТ-ПЦР не делали. В исходном штамме белок экспрессируется, результаты корректные и точные. полученный мутанты является штаммом-продуцентом этого белка, при том в таком количестве, что реал-таймом ничего подтверждать не нужно. Ин виво это на биомоделях имелось в виду. А ИФА определяли продукцию белка, ошибки при таких различиях быть не может. К сожалению подробности не имею права расписывать. длинношеее, а можно про "один постртранскрипционный механизм" поподробнее? нет слов, ппг нервно курит в углу..... |
dlinnosheee Постоянный участник |
(tsagan @ 28.03.2010 16:08) там не один, а куча посттранскрипционных механизмов, может не совсем корректно их называть посттранскрипционными, скажем так, не связанных с инициацией транскрипции. Например RNAP pausing и.т.д. У прокариотов вообще проще с этими делами, потому как систама простая и более-менее изучена. В особенности если у вас известная система типа е.коли. Вот например статейка про один эпизод из жизни фага лямбда в е.коли, где на ДНК ничего не происходит, а терминация идет за счет связывания с мРНК. Ну а соответственно если эта мРНК была на ДНКе которую вы отрезали, то в исходном штамме допустим была терминация, а в новом штамме терминации нет. Сообщение было отредактировано dlinnosheee - 28.03.2010 15:35 Файл/ы:
|
dlinnosheee Постоянный участник |
|
tsagan Постоянный участник |
|
tsagan Постоянный участник |
(gost' @ 28.03.2010 16:31) Обоснуйте. Это хорошо когда у Вас есть возможность проводить эксперименты на хорошем и современном оборудовании, заказать реактивы, и они будут через 1-2 недели, а если у нас нет возможности сделать все возможные эксперименты, изучить со всех сторон, нам теперь не делать эксперименты? не заниматься наукой? пойти грузчиками работать? Суть этого форума, как я понимаю, у других может и другое понимание, помочь, дать профессиональный совет. Если у кого-то возникли затруднения, то направить его. Пусть мы ошибаемся, эксперименты неправильные делаем, но мы все равно учимся (пусть и на собственных ошибках) даже на отрицательных результатах. И большое спасибо Esya, dlinnosheee, VVolkov, petr за то, что они вникают в проблему и дают советы. А так огульно критиковать, это непрофессионально в первую очередь. |
dlinnosheee Постоянный участник |
(tsagan @ 28.03.2010 17:21) Обоснуйте. Это хорошо когда у Вас есть возможность проводить эксперименты на хорошем и современном оборудовании, заказать реактивы, и они будут через 1-2 недели, а если у нас нет возможности сделать все возможные эксперименты, изучить со всех сторон, нам теперь не делать эксперименты? не заниматься наукой? пойти грузчиками работать? Тогда (что касается данной задачи) надо сделать упор на биоинформатику. Тут довольно много чего можно выудить без экспериментов. |
VVolkov Постоянный участник |
Том статьи поставляет на fulltext и детей нянчит. ))) |
dlinnosheee Постоянный участник |
(tsagan @ 27.03.2010 02:48) Среди редуцированных генов нет транскрипционных регуляторов, сайты связывания (их три в исходном так и в производном штаммах) регуляторного белка остались неизменными. Сделайте сравнение последовательности ваших известных трех сайтов с последовательностью которую вы отрезали. Если найдете участки хотя бы 70% сходства - это и есть ваши новые сайты (которые до вас были неизвестны). А это уже тема для статьи. |
dlinnosheee Постоянный участник |
(VVolkov @ 28.03.2010 19:54) За что ему огромное спасибо. Мне присылал. А в разговоре резковат |
gost' IP-штамп: frE1krxZbrc3w гость |
(dlinnosheee @ 28.03.2010 18:57) Не надо грязи!!!) резковат, если ты в самом деле считаешь себя " ботаником" значит думать должен и уметь планировать ескрименты исходя из имеющихся возможностей, а не выдавать скажем так не совсем адекватные результаты за открытие. одно слово матчасть надо знать. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |