Дорогие коллеги, помогите разобраться.
У нас есть прокариотический оперон, который синтезирует белок Х. Мы добились гиперэкспрессии этого белка (причем гены хромосомные, просто редуцировали часть генов с 5'-конца), предположение было, что изменилась промоторная область, так как по экспериментам экспрессия стала независимая от регуляторных генов. Секвенировали промотор, а он не изменился  . Пока нет возможности сделать 5'-RACE. Если не изменился промотор, то как с него увеличилась экспрессия?

никуда не встраивали, редуцировали гены с 5'-конца.

 по экспериментам экспрессия стала независимая от регуляторных генов.

  Дорогие коллеги, помогите разобраться.
У нас есть прокариотический оперон, который синтезирует белок Х. Мы добились гиперэкспрессии этого белка (причем гены хромосомные, просто редуцировали часть генов с 5'-конца), предположение было, что изменилась промоторная область, так как по экспериментам экспрессия стала независимая от регуляторных генов. Секвенировали промотор, а он не изменился  . Пока нет возможности сделать 5'-RACE. Если не изменился промотор, то как с него увеличилась экспрессия?

  Дорогие коллеги, помогите разобраться.
У нас есть прокариотический оперон, который синтезирует белок Х. Мы добились гиперэкспрессии этого белка (причем гены хромосомные, просто редуцировали часть генов с 5'-конца), предположение было, что изменилась промоторная область, так как по экспериментам экспрессия стала независимая от регуляторных генов. Секвенировали промотор, а он не изменился  . Пока нет возможности сделать 5'-RACE. Если не изменился промотор, то как с него увеличилась экспрессия?

  Дорогие коллеги, помогите разобраться.
У нас есть прокариотический оперон, который синтезирует белок Х. Мы добились гиперэкспрессии этого белка (причем гены хромосомные, просто редуцировали часть генов с 5'-конца), предположение было, что изменилась промоторная область, так как по экспериментам экспрессия стала независимая от регуляторных генов. Секвенировали промотор, а он не изменился  . Пока нет возможности сделать 5'-RACE. Если не изменился промотор, то как с него увеличилась экспрессия?

  Мальчики (или девочки), вам известны все сайты всех регуляторных белков? Поделитесь мудростью 

Если вы это все знаете, то что вы на форуме ищите?    Я хочу такое знание... Где берут такую программу...

  Я конечно плохо разбираюсь в прокариотической регулции транскрипции, но тем не менее. Вы как смотрели экспрессию? Вестерном или РеалТаймом?
Собственно я к тому, что как Вы сделали вывод, что это увеличилась экспрессия, а не стабильность транскрипта или белка?

  оперон регулируется только 1! белком.

  ну если вы знаете сайт связывания этого белка в промотерной области исходного штамме, то можете сделать выравнивание по той ДНК которую вы отрезали, и элементарно узнаете, отрезали ли вы потенциальные сайты связывания этого белкал.

а по поводу того, что регулируется только одним белком - тут вы отметаете априори массу возможностей того, что сам этот белок в свою очередь кем-то регулируется, и вполне возможно что кем-то кого вы отрезали

  tsagan - а Вы смотрели сайты связывания для всех белков данного организма? По протеомике пробивали? В соавторы включите за идею? Или просто шутите? Про изменение экспресии, конечно.

  Я и на благодарность согласен и оттиск статьи с аффтографом. Желательно на английском Хотя в соавторы лучше...

  Так в том то и дело, что сайты остались без изменений.

  Вы имеете в виду сайты в промотерной области, а я имею в виду дополнительные сайты для того же белка вне промотерной области. Посмотрите на картинку которую я выше пристегнул, там объясяется

  А у Вас новый сайт для кого нибудь не образовался ли при делеции?

  ага, или промотер

 
У нас есть прокариотический оперон, который синтезирует белок Х. Мы добились гиперэкспрессии этого белка (причем гены хромосомные, просто редуцировали часть генов с 5'-конца), предположение было, что изменилась промоторная область, так как по экспериментам экспрессия стала независимая от регуляторных генов.

 
Экспрессию определяли ИФА и in vivo.

  мРНК или белок?

  мРНК или белок?

  а как енто ИФА мРНК? париж не знал такого разврата)

  "мРНК" это было не про ИФА а про неизвестный метод [in vivo]. На тему того, что изменение сигнала в 1000 раз и отсутствие зависимости от регуляторного белка - это больше похоже на регуляцию на другой стадии уже после инициации транскрипции.

  Если не секрет, какая посттранскрипционная регуляция обеспечивает изменение сигнала в 1000 раз? На этом уровне же fine control чаще осуществляется... там эффект в 10 раз редкость.

  интересно с каких пор ртпициар или реал тайм даже называется [in vivo]?

  РТ-ПЦР не делали. В исходном штамме белок экспрессируется, результаты корректные и точные. полученный мутанты является штаммом-продуцентом этого белка, при том в таком количестве, что реал-таймом ничего подтверждать не нужно. Ин виво это на биомоделях имелось в виду. А ИФА определяли продукцию белка, ошибки при таких различиях быть не может. К сожалению подробности не имею права расписывать.
длинношеее, а можно про "один постртранскрипционный механизм" поподробнее?

 
dlinnosheee, а можно про "один постртранскрипционный механизм" поподробнее?

  нет слов, ппг нервно курит в углу.....

  Обоснуйте.
Это хорошо когда у Вас есть возможность проводить эксперименты на хорошем и современном оборудовании, заказать реактивы, и они будут через 1-2 недели, а если у нас нет возможности сделать все возможные эксперименты, изучить со всех сторон, нам теперь не делать эксперименты? не заниматься наукой? пойти грузчиками работать?

  Среди редуцированных генов нет транскрипционных регуляторов, сайты связывания (их три в исходном так и в производном штаммах) регуляторного белка остались неизменными.

  
Том статьи поставляет на fulltext

  За что ему огромное спасибо. Мне присылал. А в разговоре резковат