Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Пропидиум йодид как контроль целостности мембраны при иммунофлуоресцентном окрашивании клеток
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! AmeliRain




 прочитанное сообщение 12.07.2018 16:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Добрый вечер!
Цель эксперимента определить локализацию белка. Кто работал с пропидиум йодидом, сколько добавлять на покровное стекло с клетками для проверки целостности мембраны и на каком этапе? Сразу после фиксации, после обработки первичными антителами или после обработки вторичными антителами? Может есть ссылки на методические статьи. Заранее благодарю за помощь
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 12.07.2018 18:07     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

на мой взгляд абсолютно бессмысленное занятие определять целостность мембраны у мертвых фиксированных клеток. более того, это никаким образом не имеет отношения к цели вашего эксперимента.
чем фиксировать будете? метанол дырявит мембрану и так. а если ПФА - то обычно еще пермеабилизуют мембрану детергентом чтобы антитела лучше проходили в клетки.

в чем смысл проверки целостности мембраны в вашем случае?

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): AmeliRain
Участник оффлайн! AmeliRain




 прочитанное сообщение 12.07.2018 23:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

(ship @ 12.07.2018 19:07)
Ссылка на исходное сообщение  на мой взгляд абсолютно бессмысленное занятие определять целостность мембраны у мертвых фиксированных клеток. более того, это никаким образом не имеет отношения к цели вашего эксперимента.
чем фиксировать будете? метанол дырявит мембрану и так. а если ПФА - то обычно еще пермеабилизуют мембрану детергентом чтобы антитела лучше проходили в клетки.

в чем смысл проверки целостности мембраны в вашем случае?


домены белка располагаются внутри и снаружи мембраны. Пермеабилизация с помощью тритона, возможно, что один из доменов белка располагается в цитоплазме и в условиях без тритона сигнала гораздо меньше,но он все же есть и поэтому нужен контроль целостности клетки, так как нам в этом случае дырки не нужны. Фиксируем параформальдегидом.


То есть нам не нужно чтобы антитела попадали внутрь в условиях без тритона, но они могли попасть , для этого и нужен контроль целостности клетки, чтобы уже точно определить локализацию доменов белка на мембране. Для контроля расположения клеток дапи, он спокойно проходит и в целые и в повреждённые клетки

Сообщение было отредактировано AmeliRain - 12.07.2018 23:02
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.07.2018 06:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Гугл тут же выдает концентрацию 10 мкг/мл, как 10-20х раствор.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NMR-guy
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 13.07.2018 11:17     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

А к какому эпитопу белка антитела Вам не известно? К внешнему или внутриклеточному?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.07.2018 12:54     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Ship , именно это они и хотят проверить.

Сообщение было отредактировано MMM - 13.07.2018 13:57

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): AmeliRain
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 13.07.2018 13:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

а чем иммунизировали типа неизвестно? сомневаюсь что прям полноразмерным рекомбинантным белком, так как если он трансмембранный то получить его в чистом виде в количествах нужных для иммунизации кролика та еще задача
Участник оффлайн! AmeliRain




 прочитанное сообщение 13.07.2018 17:00     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

(ship @ 13.07.2018 14:41)
Ссылка на исходное сообщение  а чем иммунизировали типа неизвестно? сомневаюсь что прям полноразмерным рекомбинантным белком, так как если он трансмембранный то получить его в чистом виде в количествах нужных для иммунизации кролика та еще задача

Антитела к различным эпитопам. Структура белка ещё не описана, есть только биоинформатическая модель
Участник оффлайн! AmeliRain




 прочитанное сообщение 13.07.2018 17:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(ship @ 13.07.2018 14:41)
Ссылка на исходное сообщение  а чем иммунизировали типа неизвестно? сомневаюсь что прям полноразмерным рекомбинантным белком, так как если он трансмембранный то получить его в чистом виде в количествах нужных для иммунизации кролика та еще задача

Первичная структура полностью расшифрована* изучаем только пространственную. Конечно известно чем иммунизировали
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 13.07.2018 17:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

то есть знаете что иммунизировали на определенный эпитоп, но не знаете где он находится?

мне кажется вам скорее надо на проточник и красить флуоресцентно меченными антителами. пометить можно самим. клетки не фиксируются.
покрасилось - эпитоп на поверхности клетки, не красится или слабо - эпитоп в цитоплазме или мембране.

и потом у вас просто клетки на покровном стекле то при иммунофлуоресценции сложно будет различить сигнал с поверхности и из цитоплазмы.
если вы конечно не делате какие Super resolution microscopy

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): AmeliRain
Участник оффлайн! AmeliRain




 прочитанное сообщение 13.07.2018 18:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

(ship @ 13.07.2018 18:18)
Ссылка на исходное сообщение  то есть знаете что иммунизировали на определенный эпитоп, но не знаете где он находится?

мне кажется вам скорее надо на проточник и красить флуоресцентно меченными антителами. пометить можно самим. клетки не фиксируются.
покрасилось - эпитоп на поверхности клетки, не красится или слабо - эпитоп в цитоплазме или мембране.

и потом у вас просто клетки на покровном стекле то при иммунофлуоресценции сложно будет различить сигнал с поверхности и из цитоплазмы.
если вы конечно не делате какие Super resolution microscopy

Спасибо)
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 13.07.2018 18:58     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Так все что покрасилось АТ в таких непрокрашенных PI клетках, то должно быть снаружи. Ибо туда куда не прошел PI, АТ и подавно не пройдут. А на протоке это делать или на слайде это вопрос затрат труда, времени и наличия оборудования.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): AmeliRain
Участник оффлайн! AmeliRain




 прочитанное сообщение 13.07.2018 19:37     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

(MMM @ 13.07.2018 19:58)
Ссылка на исходное сообщение  Так все что покрасилось АТ в таких непрокрашенных PI клетках, то должно быть снаружи. Ибо туда куда не прошел PI, АТ и подавно не пройдут. А на протоке это делать или на слайде это вопрос затрат труда, времени и наличия оборудования.

Да именно так, осталось только продумать схему эксперимента и найти побольше информации про него. Проточная цитометрия может быть уже последующим этапом

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 19.10.18 02:27
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft