Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
dimi4 Участник |
Есть ли методы как это сделать, например гибридизацией специфичного зонда 50 и более bp, с каким-нибудь тагом. |
Andrew Постоянный участник Москва |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(dimi4 @ 19.10.2012 10:39) Собственно имеется геномная ДНК, выделеная и очищенная стандартно (фенол, спиртик). Есть необходимость выцепить отдельную хромосому, можно немного порушенную. Есть ли методы как это сделать, например гибридизацией специфичного зонда 50 и более бп, с каким-нибудь тагом. биотин-олиги на всю хромосому - потом стрептавидин магнитные шарики но дорого выйдет |
dimi4 Участник |
Про форез не догнал, то что в агарозе геномка бежит на уровне 100kb скажем (не уверен), совсем ничего не говорит о степени ее деградации. В конце концов есть пульс-элктрофорез. Да и не собирался я гнать это все в гелях. Гибридизовать, хватать за метку и на сиквенс. Биотин олиги, вот мне и хочется одним олигом выцепить как можно больше. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(dimi4 @ 19.10.2012 11:54) Немного упростим задачу. С хромосомой я конечно загнул, для начала удовлетворят 100-200 кб. Про форез не догнал, то что в агарозе геномка бежит на уровне 100кб скажем (не уверен), совсем ничего не говорит о степени ее деградации. В конце концов есть пульс-элктрофорез. Да и не собирался я гнать это все в гелях. Гибридизовать, хватать за метку и на сиквенс. Биотин олиги, вот мне и хочется одним олигом выцепить как можно больше. 100-200 бп не более - так что крушите свою хромосому до мелких кусочков |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(dimi4 @ 19.10.2012 11:54) Немного упростим задачу. С хромосомой я конечно загнул, для начала удовлетворят 100-200 кб. Про форез не догнал, то что в агарозе геномка бежит на уровне 100кб скажем (не уверен), совсем ничего не говорит о степени ее деградации. В конце концов есть пульс-элктрофорез. Да и не собирался я гнать это все в гелях. Гибридизовать, хватать за метку и на сиквенс. Биотин олиги, вот мне и хочется одним олигом выцепить как можно больше. какое обогащение планируете 10, 100 раз ? |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(dimi4 @ 19.10.2012 11:54) Немного упростим задачу. С хромосомой я конечно загнул, для начала удовлетворят 100-200 кб. Про форез не догнал, то что в агарозе геномка бежит на уровне 100кб скажем (не уверен), совсем ничего не говорит о степени ее деградации. В конце концов есть пульс-элктрофорез. Да и не собирался я гнать это все в гелях. Гибридизовать, хватать за метку и на сиквенс. Биотин олиги, вот мне и хочется одним олигом выцепить как можно больше. может проще 10 лонг ПЦР сделать ? |
Andrew Постоянный участник Москва |
(dimi4 @ 19.10.2012 09:54) Немного упростим задачу. С хромосомой я конечно загнул, для начала удовлетворят 100-200 kb. Про форез не догнал, то что в агарозе геномка бежит на уровне 100kb скажем (не уверен), совсем ничего не говорит о степени ее деградации. В конце концов есть пульс-элктрофорез. Да и не собирался я гнать это все в гелях. Гибридизовать, хватать за метку и на сиквенс. Биотин олиги, вот мне и хочется одним олигом выцепить как можно больше. Вот как раз на пульс-форезе вы и увидите, что выделенная таким образом геномка едва ли превышает 100 кб (в лучшем случае). Чтобы получить более высокомолекулярную ДНК используют совсем другие методы выделения. |
xenopus Постоянный участник Moscow |
|
Guest IP-штамп: frF63nlCtDizk гость |
или сходите на вебминар |
RNK Постоянный участник СССР |
ДНК фрагментируется в каждом случае по разному и хромосома в этой ДНК, представляет собой набор очень разной длины разорванной в очень разных местах. Надо сортировать хромосомы и потом выделять ДНК из этого.
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Но "изоляция отдельных хромосом из геномной ДНК (пусть даже метафазных) - это жесть, пардон. полная ... |
guest: ммм IP-штамп: frQlBxj4iQSg. гость |
|
dimi4 Участник |
Это поиск снипов, либо других мутаций после мутагенеза и скрининга у мушек. Там определяется примерный район, примерно 100kb, плюс минус. Есть желание вытащить этот район зондом и на NGS. Long PCR как-то не прижился. Точнее сказать до NGS, сейчас может и достаточно дешево будет все прочитать. Насколько мне видится одна из проблем (опуская качество ДНК), это гибридизация зонда, подобрать условия чтобы и зонд сел, и геномка не сильно друг на друга залипла. |
guest: ммм IP-штамп: frQlBxj4iQSg. гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(dimi4 @ 22.10.2012 06:58) Немного про саму задачу. Это поиск снипов, либо других мутаций после мутагенеза и скрининга у мушек. Там определяется примерный район, примерно 100кб, плюс минус. Есть желание вытащить этот район зондом и на НГС. Лонг ПЦР как-то не прижился. Точнее сказать до НГС, сейчас может и достаточно дешево будет все прочитать. Насколько мне видится одна из проблем (опуская качество ДНК), это гибридизация зонда, подобрать условия чтобы и зонд сел, и геномка не сильно друг на друга залипла. ну мух проще просто полногеномно отсиквинировать без всяких вытаскиваний хромосом |
vtosha Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(dimi4 @ 22.10.2012 06:58) Немного про саму задачу. Это поиск снипов, либо других мутаций после мутагенеза и скрининга у мушек. Там определяется примерный район, примерно 100kb, плюс минус. Есть желание вытащить этот район зондом и на NGS. Long PCR как-то не прижился. Точнее сказать до NGS, сейчас может и достаточно дешево будет все прочитать. Насколько мне видится одна из проблем (опуская качество ДНК), это гибридизация зонда, подобрать условия чтобы и зонд сел, и геномка не сильно друг на друга залипла. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(dimi4 @ 22.10.2012 06:58) Немного про саму задачу. Это поиск снипов, либо других мутаций после мутагенеза и скрининга у мушек. Там определяется примерный район, примерно 100kb, плюс минус. Есть желание вытащить этот район зондом и на NGS. Long PCR как-то не прижился. Точнее сказать до NGS, сейчас может и достаточно дешево будет все прочитать. Насколько мне видится одна из проблем (опуская качество ДНК), это гибридизация зонда, подобрать условия чтобы и зонд сел, и геномка не сильно друг на друга залипла. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(dimi4 @ 22.10.2012 06:58) Немного про саму задачу. Это поиск снипов, либо других мутаций после мутагенеза и скрининга у мушек. Там определяется примерный район, примерно 100кб, плюс минус. Есть желание вытащить этот район зондом и на НГС. Лонг ПЦР как-то не прижился. Точнее сказать до НГС, сейчас может и достаточно дешево будет все прочитать. Насколько мне видится одна из проблем (опуская качество ДНК), это гибридизация зонда, подобрать условия чтобы и зонд сел, и геномка не сильно друг на друга залипла. 12 мух на одну дорожку ХиСека - итого 10 000 рублей на геном мухи - потратитесь больше на "выделение хромосомы" |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(vtosha @ 22.10.2012 09:54) Если НГС доступен, то есть ли смысл парится с выделением отдельной хромосомы? Тем более, геном дрозофилы отсеквенирован. 168 геномов |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(dimi4 @ 22.10.2012 06:58) Немного про саму задачу. Это поиск снипов, либо других мутаций после мутагенеза и скрининга у мушек. Там определяется примерный район, примерно 100kb, плюс минус. Есть желание вытащить этот район зондом и на NGS. Long PCR как-то не прижился. Точнее сказать до NGS, сейчас может и достаточно дешево будет все прочитать. Насколько мне видится одна из проблем (опуская качество ДНК), это гибридизация зонда, подобрать условия чтобы и зонд сел, и геномка не сильно друг на друга залипла. |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |