Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
DimVik |
Gentlemen! Who knows how to determine the presence of DNA in a sample after isolation. Electrophoresis, spectrophotometer, fluorimeter in short, nothing. There is a Real Time amplifier. I will be very happy to hear from You. |
Ash Участник |
|
DimVik |
|
Ash Участник |
Навскидку что-то вроде Годится? |
Ash Участник |
|
Ash Участник |
|
DimVik |
|
vb Постоянный участник |
|
vb Постоянный участник |
|
DimVik |
|
genseq Постоянный участник |
Ампликон - 118N: Forward: TCCACCCCTTTGCCCAGACACA 22N 66º Reverse: AGGAAAGGCGGCACCACCACA 21N 67º Сообщение было отредактировано genseq - 13.01.2021 15:17 |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
|
Ash Участник |
|
Vadim Sharov Постоянный участник Россия |
|
Ash Участник |
(Vadim Sharov @ 13.01.2021 18:29) У меня есть подсознательное подозрение, что дешевле купить спектрофотометр, чем затевать кухню с синтезом праймеров, да и полимераза с красителем не копейки. Да ну, два праймера минимальное количество тысячи полторы, полимераза не заоблачно стоит, как и SybrGreen.... для нужд автора хватит минимального количества надолго. |
DimVik |
|
Ash Участник |
|
DimVik |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(DimVik @ 14.01.2021 13:58) Праймеры? Да были, в коммерческом наборе Гордиз Cattle. По поводу сиквенса договорились с Белгородом. В STR идентификации конечно нужно знать сколько добавлять ДНК в реакционную пробирку (достаточно 1-10 нг для рутинных работ). Когда-то я выбирал эти самые STR праймеры для лошадей и КРС. Значит, кроме реал-тайм ПЦР у Вас есть и капиллярник тоже, то бишь секвенатор? Мой совет, пользуйтесь испытанным китом для выделения ДНК, который "не теряет ДНК" в процессе, они есть в продаже (не буду заниматься рекламой). Иногда можно и не выделять ДНК, а делать "директ ПЦР". А Белгород прямо васюки 21 века. |
genseq Постоянный участник |
|
DimVik |
(-Ъ- @ 14.01.2021 18:38) В STR идентификации конечно нужно знать сколько добавлять ДНК в реакционную пробирку (достаточно 1-10 нг для рутинных работ). Когда-то я выбирал эти самые STR праймеры для лошадей и КРС. Значит, кроме реал-тайм ПЦР у Вас есть и капиллярник тоже, то бишь секвенатор? Мой совет, пользуйтесь испытанным китом для выделения ДНК, который "не теряет ДНК" в процессе, они есть в продаже (не буду заниматься рекламой). Иногда можно и не выделять ДНК, а делать "директ ПЦР". А Белгород прямо васюки 21 века. День добрый! Нет секвенатора нет. Есть только Real-Time. Наборы используем отечественные, качество устраивает, цена тоже. Проблема бывает в том что исходного материала для выделения очень мало и возникают сомнения достаточно для дальнейшей работы или нет? СПАСИБО умным людям теперь знаем как проверить, пока не купим спектрофотометр. Белгород топчик! Тепло, светло много домашнего винограда хорошие люди грамотные специалисты. Для работы есть все что надо. |
genseq Постоянный участник |
U8528 GCTCGCTTGATCTTGATTTTCAGTACGAATACA 33N 66° L8743 CAGCTCACGTTCCCTATTAGTGGGTGAACA 30N 68° Рассчитаны на ген 28S RNA (рибосомная РНК). Подбирал для контроля выделения ДНК/РНК в кошачьей тест-системе, но они идеально походят и для человека, и для коровы, и даже для нематод. |
Ash Участник |
(genseq @ 18.01.2021 10:38) Кстати, о праймерах. Если ставить Real-Time PCR с краcителями, то ампликоны лучше брать подлиннее. Вот пример "из закромов" для ампликона длиной 250N: U8528 GCTCGCTTGATCTTGATTTTCAGTACGAATACA 33N 66° L8743 CAGCTCACGTTCCCTATTAGTGGGTGAACA 30N 68° Рассчитаны на ген 28S RNA (рибосомная РНК). Подбирал для контроля выделения ДНК/РНК в кошачьей тест-системе, но они идеально походят и для человека, и для коровы, и даже для нематод. Главное, в таком случае, чтобы не законтаминировали человеческими образцами.... |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(genseq @ 18.01.2021 13:38) Чем длиннее, тем интенсивнее светятся? Глубоко ошибаешься, маэстро! Чем короче ампликон, тем эффективнее реакция, и даже на вдрыск порванной ДНК (РНК), так что не надо ля-ля. Иногда на порядки чувствительность выше!
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(DimVik @ 18.01.2021 09:33) День добрый! Нет секвенатора нет. Есть только Real-Time. Наборы используем отечественные, качество устраивает, цена тоже. Проблема бывает в том что исходного материала для выделения очень мало и возникают сомнения достаточно для дальнейшей работы или нет? СПАСИБО умным людям теперь знаем как проверить, пока не купим спектрофотометр. Белгород топчик! Тепло, светло много домашнего винограда хорошие люди грамотные специалисты. Для работы есть все что надо. СФ, нонадропы - это дорого. В последние годы все Qubit покупали, но и он сейчас смотрю подорожал Сообщение было отредактировано -Ъ- - 18.01.2021 15:05 |
DimVik |
(genseq @ 18.01.2021 17:38) Кстати, о праймерах. Если ставить Real-Time PCR с краcителями, то ампликоны лучше брать подлиннее. Вот пример "из закромов" для ампликона длиной 250N: U8528 GCTCGCTTGATCTTGATTTTCAGTACGAATACA 33N 66° L8743 CAGCTCACGTTCCCTATTAGTGGGTGAACA 30N 68° Рассчитаны на ген 28S RNA (рибосомная РНК). Подбирал для контроля выделения ДНК/РНК в кошачьей тест-системе, но они идеально походят и для человека, и для коровы, и даже для нематод. День добрый! Щедро! СПАСИБО! Принято. Попробуем при первой возможности. |
DimVik |
(-Ъ- @ 18.01.2021 19:58) СФ, нонадропы - это дорого. В последние годы все Qubit покупали, но и он сейчас смотрю подорожал Да рассматривали такой вариант. Но решили с калибровками и расходниками не заморачиваться. Сегодня на них одни цены, завтра другие. Деньгами на спектрофотометр обещали, но во второй половине года. Выбрали пока такой: |
DimVik |
По поводу праймеров для КРС и Лошадей! Вот это экстремально интересная информация. Как воздух нужна. Изыскиваем в научных статьях. Но некоторые при проверке оказываются кривые. Да и уровень знаний пока что не позволяет разобраться в тонкостях. Особенно как к примеру 30 праймеров будут вести себя в одной пробе. У Гордиза получается конечно. И то рекомендует понижение скорости в протоколе. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
По поводу праймеров для КРС и Лошадей! Вот это экстремально интересная информация. Как воздух нужна. Изыскиваем в научных статьях. Но некоторые при проверке оказываются кривые. Да и уровень знаний пока что не позволяет разобраться в тонкостях. Особенно как к примеру 30 праймеров будут вести себя в одной пробе. У Гордиза получается конечно. И то рекомендует понижение скорости в протоколе. [/quote] Да ради бога, не жалко, пользуйтесь, сейчас все доступно! Это правда, что некоторые праймеры нужно корректировать - у каждого своя кухня. И все краски к ним могем сделать, также как и сайз стандарты и все прочее... Аллельный ладдер для крс, свиней, кошек, собак и крокодилов это слишком жирно. Хоть 25 пар праймеров в одной пробирке! Но никакого желания, так как все перепробовал, удовлетворился...вообщем не боги горшки обжигают. А советы - пожалуйста. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(DimVik @ 19.01.2021 05:39) Да рассматривали такой вариант. Но решили с калибровками и расходниками не заморачиваться. Сегодня на них одни цены, завтра другие. Деньгами на спектрофотометр обещали, но во второй половине года. Выбрали пока такой: Купите агарозный минифорез, стандартную ДНК фага Лямбда с известной точной концентрацией и вперед и вверх, как говорит всегда мой друг Генсек. |
DimVik |
|
DimVik |
(-Ъ- @ 19.01.2021 16:55) Да ради бога, не жалко, пользуйтесь, сейчас все доступно! Это правда, что некоторые праймеры нужно корректировать - у каждого своя кухня. И все краски к ним могем сделать, также как и сайз стандарты и все прочее... Аллельный ладдер для крс, свиней, кошек, собак и крокодилов это слишком жирно. Хоть 25 пар праймеров в одной пробирке! Но никакого желания, так как все перепробовал, удовлетворился...вообщем не боги горшки обжигают. А советы - пожалуйста. Понятно! ОГРОМНОЕ спасибо за помощь и совет! |
genseq Постоянный участник |
(-Ъ- @ 18.01.2021 12:52) Чем длиннее, тем интенсивнее светятся? Глубоко ошибаешься, маэстро! Чем короче ампликон, тем эффективнее реакция, и даже на вдрыск порванной ДНК (РНК), так что не надо ля-ля. Иногда на порядки чувствительность выше! Лично я в вопросах Real-Time PCR теоретик. А мой друг Ъ - практик. Так что лучше верить ему. Несмотря на то, что теоретически я "правее". С красителями (при равных количествах праймеров) длинные ампликоны (250N) должны светить примерно в два раза сильнее коротких (118N). Но это только теоретически. Практически - нужно проверять. Проверить постараюсь в феврале. Тем более, что мне тоже пора осваивать контроль качества выделения ДНК. Пытался задействовать для этого доктора наук, "съевшего собаку" на флуоресценции ДНК, но он недавно неожиданно умер. Сообщение было отредактировано genseq - 19.01.2021 20:13 |
DimVik |
(genseq @ 20.01.2021 01:08) Лично я в вопросах Real-Time PCR теоретик. А мой друг Ъ - практик. Так что лучше верить ему. Несмотря на то, что теоретически я "правее". С красителями (при равных количествах праймеров) длинные ампликоны (250N) должны светить примерно в два раза сильнее коротких (118N). Но это только теоретически. Практически - нужно проверять. Проверить постараюсь в феврале. Тем более, что мне тоже пора осваивать контроль качества выделения ДНК. Пытался задействовать для этого доктора наук, "съевшего собаку" на флуоресценции ДНК, но он недавно неожиданно умер. Жаль конечно, только всему научишься и помирать приходится. Совсем недавно начал заниматься этим направлением. Безумно увлекательно! Тут встал вопрос где заказывать синтез праймеров? Давали адрес в Новосибирске, но отзывы разные по ним. В Москве наверное постабильнее? |
semi Постоянный участник Москва |
(Ash @ 18.01.2021 14:45) Точно. Если консервативные последовательности, то лучше все-таки митохондриальные, IMHO. Есть небольшой опыт с праймерами на хромосомные консервативные рибосомные повторы, которые тянут всё - от птицы до человека. С ними всё время лезет сигнал в контроле выделения. Видимо, контаминированы наборы для выделения ДНК. С митохондриальными такого нет. Сообщение было отредактировано semi - 24.01.2021 14:55 |
semi Постоянный участник Москва |
(DimVik @ 19.01.2021 13:27) Идея хорошая и напрашивается сама собой. Но к сожалению под электрофорез нужна отдельная комната. Ее пока нет. Грязноватый процесс. Если гонять на форезе выделенную геномную ДНК КРС, то риски минимальные. Это же не ампликоны или плазмиды.
|
DimVik |
(genseq @ 23.01.2021 14:06) Очень круто! Спасибо! Но это больше на перспективу. Сейчас достоверность происхождения и генетические заболевания. |
DimVik |
(semi @ 24.01.2021 20:02) Если гонять на форезе выделенную геномную ДНК КРС, то риски минимальные. Это же не ампликоны или плазмиды. Да форез выход конечно. И мы его запустим все равно. Но позже. Тем более, в помещении где его планируем сейчас крутим кровь для иммуногенетики. |
genseq Постоянный участник |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |