 * |   |
|
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда |  Zbio-wikiNG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: |
|
Правила
* Нестабильность результатов ПЦР
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.
   |
 TRIFOLIUM |
 16.09.2017 10:39
|
|
genseq Постоянный участник |
16.09.2017 13:02
(TRIFOLIUM @ 16.09.2017 08:39)  Добрый день, коллеги. Столкнулась с проблемой нестабильности воспроизводимость амплификации. В мультиплексной реакции есть микросателлит и маркер к целевому гену. Микросателлит как контроль ПЦР, а у маркера доминантная природа. Берем минус и плюс контроль, проводим ПЦР. Микросателлит есть всегда, а маркера к гену то появляется, то исчезает в разных повторностях даже в плюс контроле. В чем может быть причина? Используем смеси ДНК и уменьшенные объемы наборы реактивов для ПЦР. Погрешность реактивов?Не обращайте внимания на местные разборки. Что касается Ваших проблем, то причин может быть несколько. Например: 1. Слишком высокая концентрация микросателлитных праймеров приводит к истощению реакционной смеси, и маркёрный апиликон не успевает размножиться. 2. Нестабильность результатов может быть связана со слишком низкой температурой плавления маркёрных праймеров. 3. Тугоплавкие шпильки на маркёрном ампликоне. 4. Неучтённые при расчёте праймеров снипы на матричной ДНК. 5. И т.д., и т.п. Для решения этой проблемы желательно уменьшить количество микросателлитных праймеров (до 2...4 pM на 20 мкл), добавить энхансер и понизить на 2...4 градуса температуру отжига при термоциклировании. Если не поможет, то придётся проверять праймеры. Сообщение было отредактировано genseq - 16.09.2017 13:03 |
|
sceptique Постоянный участник временной жизни |
17.09.2017 02:43
Но скорее всего у Вас просто праймеры хреновые. Удлинняйте их и не идите в поток, пока 9 из 10 не начнут получаться. Ваш плюс-контроль внутриреакционный - лажа, если вдуматься. Микросателлиты идут абсолютно всегда, даже когда реакция по спейцифике будет ломаться. Это, кстати, - еще одна причина, по которой ваш целевой продукт не амплифицируется - ферментативной активности в единице объёма хватает на амплификацию только контроля в части случаев (чуть ниже маргинальной границы эффективности по причинам с шаблоном ДНК, описанным выше). И если бы микросателлита не было - хватало бы и на каждую реакцию специфики. |
|
TRIFOLIUM |
21.09.2017 13:17
|
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
25.09.2017 12:10
(TRIFOLIUM @ 16.09.2017 11:39) Добрый день, коллеги. Столкнулась с проблемой нестабильности воспроизводимость амплификации. В мультиплексной реакции есть микросателлит и маркер к целевому гену. Микросателлит как контроль ПЦР, а у маркера доминантная природа. Берем минус и плюс контроль, проводим ПЦР. Микросателлит есть всегда, а маркера к гену то появляется, то исчезает в разных повторностях даже в плюс контроле. В чем может быть причина? Используем смеси ДНК и уменьшенные объемы наборы реактивов для ПЦР. Погрешность реактивов?Варьируйте количество праймеров для начала. Например, на микросателлит оставьте количество как отработано, а на "маркер" берите два раз больше. А иногда приходится брать даже в 10 раз больше, но в 20-30-плексах. А нафига инфа про доминантную природу "маркера"? Лучше бы про копийность что-нибь сказали.  Сообщение было отредактировано -Ъ- - 25.09.2017 12:28 |
|
sceptique Постоянный участник временной жизни |
26.09.2017 15:37
- автор не может варьировать пары праймеров, поскольку работает как 90% его коллег готовым набором, думаю, лиофильно высушенным и "оптимизированнымсертифицированнымзарегистрированнымымдыбрЪ". Производитель не произвел оптимизацию по хранению, поскольку для этого год нужен, а у кого он есть сейчас? И плохо оптимизировал условия и скорее всего на другом приборе. - кажущаяся копийность контролей у него раз в миллиард, думаю, превышает копийность геномки, которая, как и у всех, 10-70 тыс. копий на плохо оптимизированную реакцию. "Маркер" и "микросателлит" наверняка "выбраны" разные по длине и ГЦ-составу, что еще более усугубляет ситуацию. Подписи контроля качества на реагентах наверняка нет и предъявить претензии некому, или этот некто находится за границей и тихо ржет как эти русские еще что-то ПЦРят с передержанных на комнатной температуре 2 месяца при ввозе на таможне реагентов. |
|
watchesbiz Постоянный участник |
 23.11.2021 14:55
|
|
nigoal123 IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE гость |
09.12.2021 11:36
and technical language to help potential readers find your paper. These are the words or phrases a researcher might use when searching for a paper on this topic. You can find out more in our |
| « Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2024 IPS, Inc.