Помогите! Делаю ПЦР по протоколу и с праймерами, которые работают (до меня все делали - у всех получалось, у меня - частями получалось). ПЦР-продукты получаются но не все, а должны быть.
Праймеры F: TACGATTTCTTATGTTGAGGG R: CATTGCTTTTCGTCTATCACC. 50 мкл - общая смесь,  0,2 μM каждого праймера, 200 μM dNTP, 1,25 or 1 U Taq и  1× Taq buffer (1,5 mM MgCl2). В смесь добавляю 5 мкл ДНК-матрицы. С другими праймерами все работает.  Условия:  93 °C  1 мин,  далее 35 cycles денатурация 1 мин 93 °C, отжиг 1 мин 51 °C, элонгация 1 мин 72 °C, затем 72 °C 5 мин.
Фото фореза прилагаю. Маркер длин виден, и контроль отриц в 1-й и последней лунке рядов. Два ряда, в верхнем получилось 2 образца, а остальных нет, в следующем ряду - не получилось 3 образца - остальные видны отчетливо.
Что поменять, как изменить что-то, чтобы все получилось? Посоветуйте пожалуйста!!!
Заранее благодарен!!!

  Помогите! Делаю ПЦР по протоколу и с праймерами, которые работают (до меня все делали - у всех получалось, у меня - частями получалось). ПЦР-продукты получаются но не все, а должны быть.
Праймеры F: TACGATTTCTTATGTTGAGGG R: CATTGCTTTTCGTCTATCACC. 50 мкл - общая смесь,  0,2 μM каждого праймера, 200 μM dNTP, 1,25 or 1 U Taq и  1× Taq buffer (1,5 mM MgCl2). В смесь добавляю 5 мкл ДНК-матрицы. С другими праймерами все работает.  Условия:  93 °C  1 мин,  далее 35 cycles денатурация 1 мин 93 °C, отжиг 1 мин 51 °C, элонгация 1 мин 72 °C, затем 72 °C 5 мин.
Фото фореза прилагаю. Маркер длин виден, и контроль отриц в 1-й и последней лунке рядов. Два ряда, в верхнем получилось 2 образца, а остальных нет, в следующем ряду - не получилось 3 образца - остальные видны отчетливо.
Что поменять, как изменить что-то, чтобы все получилось? Посоветуйте пожалуйста!!!
Заранее благодарен!!!

  вау питруха прорезался а все думали что ты помер       

  Не обращайте внимания на местного юродивиого...

Смущает 1.5mM MgCl2

А главное, расскажите как выделяли ДНК?

  Черри можно поподробней     

  похоже фотка на етидий бромиде на убитом трансиллюминаторе

  Не обращайте внимания на местного юродивиого...

Смущает 1.5mM MgCl2

А главное, расскажите как выделяли ДНК?

  Не обращайте внимания на местного юродивиого...

Смущает 1.5mM MgCl2

А главное, расскажите как выделяли ДНК?

  Вот другие форезы, все получается. Реакционная смесь та же, условия те же. Все гены, по которым делаем - хромосомные.

  1. Должен быть Контрольный Образец, на котором отрабатываются условия ПЦР. С Известной Концентрацией ДНК. "Известного вида".
2 Тотж. 51 не очень хорошо, оптимизируйте.
3. Форез сложно читаемый. Совет: меньше проб, хороший маркер.

Снипы в месте посадки праймера могут давать абсолютно не идущую станд.ПЦР.

  Помогите! Делаю ПЦР по протоколу и с праймерами, которые работают (до меня все делали - у всех получалось, у меня - частями получалось). ПЦР-продукты получаются но не все, а должны быть.
Праймеры F: TACGATTTCTTATGTTGAGGG R: CATTGCTTTTCGTCTATCACC. 50 мкл - общая смесь,  0,2 μM каждого праймера, 200 μM dNTP, 1,25 or 1 U Taq и  1× Taq buffer (1,5 mM MgCl2). В смесь добавляю 5 мкл ДНК-матрицы. С другими праймерами все работает.  Условия:  93 °C  1 мин,  далее 35 cycles денатурация 1 мин 93 °C, отжиг 1 мин 51 °C, элонгация 1 мин 72 °C, затем 72 °C 5 мин.
Фото фореза прилагаю. Маркер длин виден, и контроль отриц в 1-й и последней лунке рядов. Два ряда, в верхнем получилось 2 образца, а остальных нет, в следующем ряду - не получилось 3 образца - остальные видны отчетливо.
Что поменять, как изменить что-то, чтобы все получилось? Посоветуйте пожалуйста!!!
Заранее благодарен!!!

  Помогите! Делаю ПЦР по протоколу и с праймерами, которые работают (до меня все делали - у всех получалось, у меня - частями получалось). ПЦР-продукты получаются но не все, а должны быть.
Праймеры F: TACGATTTCTTATGTTGAGGG R: CATTGCTTTTCGTCTATCACC. 50 мкл - общая смесь,  0,2 μM каждого праймера, 200 μM dNTP, 1,25 or 1 U Taq и  1× Taq buffer (1,5 mM MgCl2). В смесь добавляю 5 мкл ДНК-матрицы. С другими праймерами все работает.  Условия:  93 °C  1 мин,  далее 35 cycles денатурация 1 мин 93 °C, отжиг 1 мин 51 °C, элонгация 1 мин 72 °C, затем 72 °C 5 мин.
Фото фореза прилагаю. Маркер длин виден, и контроль отриц в 1-й и последней лунке рядов. Два ряда, в верхнем получилось 2 образца, а остальных нет, в следующем ряду - не получилось 3 образца - остальные видны отчетливо.
Что поменять, как изменить что-то, чтобы все получилось? Посоветуйте пожалуйста!!!
Заранее благодарен!!!

  Спасибо всем за советы!!! Будем думать и исправлять!

  Коллектив, возглавляемый Евгением Иосифовичем, первым в СССР и одним из первых в мире применил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики мутационных повреждений ДНК. Для этих целей О. К. Кабоевым выделена и использована ДНК-полимераза из культуры термофильной бактерии Thermus thermofilis, привезенной из экспедиции на Курильские острова. Неоценимую помощь в синтезе праймеров и зондов для ПЦР оказывают сотрудники Института биоорганической химии (Москва) под руководством проф. Ю. А. Берлина. Все работы по постановке ПЦР проводятся вручную, на трех водяных термостатах лаборантом Л. И. Фроловой, режимы и реакционные смеси подбираются экспериментально.