Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* Плазмидный профиль по Экхардту
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Lec




 прочитанное сообщение 15.02.2005 17:10     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Нет ли у кого подробного описания методики разделения мегаплазмид у ризобий? Оч-чень нужно! Help!!!
Участник оффлайн! Veshka
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 15.02.2005 18:55     Сообщение для модератора         Фотография  Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

инверсник поставить smile.gif
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 16.02.2005 12:14     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Добрый день, уважаемый Lec
Мы пользуемся методикой Экхардта в модификации Злотникова К.В. для ризобий:
1. залить вертикальный аппарат 0.6% агарозой на ТВЕ, выдержать в течении ночи в холодильнике
2. осадить 1.5 мл ночной культуры, отмыть осадок в 0.5 мл Т1, осадить, тщательно слить осадок
3. ресуспендировать в 0.04 мл Т2
4. в чистые эппендорфы 0.06 мл Т3, к ним смесь Т2+культура и сразу (с минимальным ресуспендированием) переносить в колодцы в агарозе
5. последовательно наслоить Т4 и Т5 по 0.1 мл, запаять агарозой
6. вгонка в течении 1 часа при небольшом напряжении (подбирать надо для своих условий: имеют значении и параметры камеры и температура и агароза) и форез (опять же под ваши условия)

Т1: стандартный ТЕ
Т2: сахароза 5%; фиколл 15%; в полукратном ТВЕ
Т3: сахароза 5%; Фиколл 15%; РНКаза 20 мкг/мл; лизоцим 0.5 мг/мл (перед использованием); в полукратном ТВЕ
Т4: SDS 1%; фиколл 10%; в полукратном ТВЕ
Т5: SDS 1%; фиколл 5%; в полукратном ТВЕ

Таким пользуемся мы, но по слухам есть новые варианты. Том1 упоминал, что есть современные варианты Экхардта на порядок продвинутые, но ссылку не дал. Может Вам повезет и к Вам он будет более милостлив - спросите. Если Вам в руки попадет метод лучше - поделитесь и Вам воздастся.
А жадине-говядине Тому1 не будет райских кущ на том свете за его жадность! smile.gif
Удачи!
Участник оффлайн! Lec




 прочитанное сообщение 16.02.2005 14:04     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Спасибо. Имеет ли смысл вгонять далее пульсером? и насколько критична температура? каково общее время разгона? Я видел красивые картинки в статьях у Андронова, но не знаю как с ним связаться. Уважаемый Том1 не можете ли Вы поделиться капелькой знаний из Вашего Источника Истины? smile.gif
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 16.02.2005 15:38     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Уважаемый Lec, все Ваши вопросы упираются в первую очередь в массу плазмид которые Вы исследуете. Для нас критичны плазмиды с массой 85 и 120 МДа, плазмид с массой свыше 300 МДа мы пока не трогаем (хотя на форезах они получаются но редко расходятся). Мы гоним либо на столе при комнатной температуре при 100V в течении 4 часов, или 30V в холодильнике на ночь (18 ч). Но наши условия подобраны нами для разделения наших плазмид в условиях нашей камеры. Про пульсер не знаю, но думаю что это должно быть еще лучше для крупных плазмид (если метод пульсфореза вообще применим для плазмид и они не будут убегать - наверняка можно подобрать условия для плазмид).
Участник оффлайн! Rhizon
Участник



 прочитанное сообщение 16.02.2005 18:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

Мы делаем форез для ризобий так:
Форез - горизонтальный. Агароза - 0.7% + 0.4% SDS. Лизирующий буфер - 20% (w/v) сахароза на TBE 1x, + лизоцим (концетрация в зависимости от активности препарата), РНК-за.
Ночную культуру, выращенную на TY среде с хлористым кальцием, пересеваете в свежую питательную среду TY (до появления различимой глазом мутности) и инкубируете при 220 rpm 28 C еще 2 часа (время имеет большое значение). Инкубируете при +4 С еще пол-часа (без встряхивания), откручиваете примерно 500 мкл культуры, осадок быстро ресуспендируете в 30 мкл холодного лизирующего буфера и вносите в гель. Ждете 5-10 минут до просветления лизата, далее префорез при 0.5-1 в/см в течение 30 мин, далее - разделение при 3-5 в/см еще 10-15 часов. Окрашиваете и фотографируете.
Таким способом Вы сможете разделить даже мегаплазмиды ризобий (две мегаплазмиды S.meliloti, каждая около 1500 kb, видны как две раздельные полосы).
Есть публикации о разделении плазмид (включая мегаплазмиды ризобий) с помощью пульс-фореза. Мне кажется, что на сайте,
с геномом S.meliloti,
http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/an...bacteria/rhime/
приведена именно такая фотография.
Вообще, должен предупредить, что метод этот довольно капризный.
Один из самых важных моментов - инкубация и пересев.
Кроме того, как написал Borgiv, может быть полезно гель перед форезом подержать сутки в буфере, хотя, кажется, необходимость этой стадии может быть связана с маркой агарозы.

[ 16.02.2005, 21:51: Сообщение отредактировано: Rhizon ]
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 17.02.2005 11:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Добрый день, уважаемый Rhizon, я совсем забыл упомянуть что мы работаем с азоспириллой, поэтому считаю, что Ваша методика более уместна в ответе на вопрос топика, кстати форез мы ставим вертикальный.
Меня очень заинтересовала Ваша методика, для блоттинга мы ставим также горизонтальный форез на ТАЕ.
У меня возникло несколько методических вопросов: зачем выдерживать культуру перед форезом в холодильнике; запаиваете ли Вы лунки перед форезом; не слышали ли Вы об использовании Вашей методики для других бактерий (я хочу попробовать адаптировать ее для себя)?
Заранее благодарен, Игорь
Участник оффлайн! Rhizon
Участник



 прочитанное сообщение 17.02.2005 12:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

Здравстуйте, Игорь,
Конечно, вид микроорганизма очень важен. Например, для E.coli Вы можете и не трудиться с пересевами, делать лизат сразу из ночной культуры (или даже из колонии, взятой с твердой среды). А вот с ризобиями так не выйдет. Вертикальный форез и запаивание лунок Вы делаете потому, что Ваша схема предполагает вхождение SDS в лизат из верхнего слоя, который нельзя разрушать. Мы упрощаем эту стадию, SDS входит в лизат из геля при префорезе, и поэтому в запаивании лунок нет нужды. Стадия с холодильником не слишком обязательна, однако это иногда бывает удобно по техническим соображениям - Вы можете сделать перерыв на пол-часа или более.
Кстати, для длинных форезов не хватает буферной емкости TAE 1x, поэтому для Экхардта мы предпочитаем TBE. Метод можно использовать и для других видов бактерий, однако, придется делать какие-то модификации.
Участник оффлайн! Lec




 прочитанное сообщение 17.02.2005 13:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Спасибо всем большое за советы и обсуждение. Меня еще интересует зависят ли результаты от формы и объема лунок? от толщины геля? И как наносить: в "сухой" гель? (при этом часть жидкости неизбежно уходит в гель), под буфер? (наносимая жидкость все время пытается всплыть), чтобы буфер был вровень с гелем но не затапливал? (в лунки у меня все равно просачивается ТВЕ т.к. гель практически полужидкий)) Как вы обходите эти трудности? Алексей
Участник оффлайн! borigv
Постоянный участник
г. Саратов



 прочитанное сообщение 17.02.2005 14:46     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Вначале для уважаемого Алексея. По технологии подготовки форезной камеры (вертикальной) изначально над агарозой слой буфера. Буфер из верхней камеры отбирается, гребенка вытаскивается, пипеткой удаляется из карманов остатки буфера и наносится проба. Речь о том, что весь гель находился под буфером и он "насыщен" буфером, если карманы не подтекают ничего не будет всасываться из объема пробы. Я не думаю что Вам критично знать (если критично - напишите) какой толщины к нас гель - камеры мы изготовляли сами (или они пущинского выпуска?, не помню). Если Вам важно знать параметры НАШЕГО геля и НАШЕЙ гребенки - напишите, я замерю.
Уважаемый Rhizon, мы ставим форез на ТАЕ только ради гибридизации, наша система чувствительна к бору, во всех остальных случаях ТВЕ. При этом мы не наслаиваем буферы с SDS в карманы, а заливаем полоску содержащию этот детергент выше карманов. Но Ваши результаты меня очень впечатлили. К сожалению наш способ горизонтального фореза более капризен чем вертикального, а усовершенствовать надо (для нас важно показывать какова локализация генов в геноме), Вы после внесения пробы в гель гоните форез сразу или даете постоять, буфер гель покрывает или вровень?
Участник оффлайн! Rhizon
Участник



 прочитанное сообщение 17.02.2005 15:06     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Мы все пробы наносим под буфер (они не всплывают, так как лизирующий буфер содержит 20% сахарозы), затем даем время подействовать лизоциму (5-10 мин), а дальше - префорез и форез.
Участник оффлайн! MariiaCh




 прочитанное сообщение 01.03.2018 11:55     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

Здравствуйте, Rhizon и borigv, извините за беспокойство. Скажите, пожалуйста, вы ещё занимаетесь постановкой этого метода, можно с вами проконсультироваться по поводу методики?
Скажите, пожалуйста, вы ещё занимаетесь постановкой этого метода, можно с вами проконсультироваться по поводу методики?
Подскажите, пожалуйста, толщину геля при проведении горизонтального фореза по Экхарду (имеет ли она значение), форма лунок (широкие/узкие)?
При проведении Экхарда у меня не получается получить полосы плазмид, вместо них однородные шмеры ДНК (если необходимо могу прислать фотографию), может ли это быть связано с некорректно проведенным лизисом (много лизоцима - 2 мкг на 500 мкл лиз. буф. или долго лизируется 10 мин), или поломка ДНК может происходить при ресуспендировании в лизирующем буфере (мешаю двумя нажатиями носика автоматической пипетки).
(Моя методика, в целом, совпадает с описанной Rhizon, но гель 0,6% и SDS 0,2%)
Участник оффлайн! Rhizon
Участник



 прочитанное сообщение 01.03.2018 16:08     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

О, 13 лет прошло....
Экхардт все еще актуален (на самом деле, хороший метод),
мы его до сих пор используем.
Вы не написали самого главного, какие у Вас микроорганизмы
и какого размера плазмиды.
Участник оффлайн! MariiaCh




 прочитанное сообщение 01.03.2018 22:53     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Да))
Мы работаем на ризобиях. Разделить надо две мегаплазмиды (около 1500 тпн) и криптические плазмиды (100-500 тпн).
Участник оффлайн! Rhizon
Участник



 прочитанное сообщение 02.03.2018 11:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

Т.к. разница между мегаплазмидами всего около 10%
(я полагаю, что Вы имеете в виду Sinorhizobium), то разделить их
будет непросто, хотя и возможно. А Вы подращивали культуру (см. протокол выше)?
Это - существенный момент.
Участник оффлайн! MariiaCh




 прочитанное сообщение 03.03.2018 00:16     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

Мы подращивали культуру 2 часа при температуре 28 градусов на качалке (200 об/мин). Потом выдерживали в холоде (+4) 30 мин.
Основная задача - получить полосы криптических плазмид. Но если с мегаплазмидами тоже получится, будет великолепно.
Участник оффлайн! Rhizon
Участник



 прочитанное сообщение 03.03.2018 17:25     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #17 множественное цитирование

Трудно сказать, почему у Вас не идет...
В общем, и посоветовать нечего, разве что, пригласить в СПб,
поставить у нас.
Участник оффлайн! MariiaCh




 прочитанное сообщение 05.03.2018 21:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #18 множественное цитирование

Очень жаль(( К сожалению, приехать в СПб не получится. В любом случае, спасибо за беспокойство.
Участник оффлайн! watchesbiz
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  20.11.2021 18:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #19 множественное цитирование

http://www.authorstream.com/Replicawatches24/
https://about.me/Replicawatches24
https://moz.com/community/users/17050093
https://trello.com/rolexrelicawatches/activity
https://replicarolexwatches.dreamwidth.org/365.html
https://visual.ly/users/watcheshutuk/portfolio
https://www.viki.com/users/watcheshutuk_549/about
https://www.academia.edu/s/14bdb7d4fe?source=link
https://www.slideshare.net/Nowseore/guide-o...ex-watch-online
https://audiomack.com/rolexrelicawatches
https://soundcloud.com/replicarolexwatches
https://www.bagtheweb.com/u/fakerolexwatches/profile
https://www.flipsnack.com/ReplicawatchesUK/...ca-watches.html
https://www.4shared.com/office/zA4L7Rmzea/G...hase_a_Fak.html?
https://codepen.io/Rolexrelicawatches/full/abBEzaQ
Участник оффлайн! watchesonline89
Постоянный участник



 прочитанное сообщение Сообщение на английском  26.12.2022 11:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #20 множественное цитирование

https://telegra.ph/Advantages-Of-Replica-Watches-08-03
https://issuu.com/home/published/_6_.docx
https://www.gta5-mods.com/paintjobs/watchesswiss
https://omegawatches89.onweb.it/
https://padlet.com/omegawatches89/je3eq9ol3xzmb9bp
https://www.pinterest.com/omegawatches89/
https://knowyourmeme.com/users/omegawatches89
https://bitcointalk.org/index.php?topic=76487.new#new
https://omegawatches89.blog.hu/
https://knowyourmeme.com/forums/general/top...f-so-why?page=1
https://penzu.com/p/c6f21f5d
https://www.reddit.com/user/omegawatches89/...are_so_popular/
https://www.vingle.net/posts/4647076
https://penzu.com/p/c68b65cc
https://diigo.com/0pige9

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 29.03.24 16:32
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft