Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Lec |
|
Veshka Постоянный участник Москва |
|
borigv Постоянный участник г. Саратов |
Мы пользуемся методикой Экхардта в модификации Злотникова К.В. для ризобий: 1. залить вертикальный аппарат 0.6% агарозой на ТВЕ, выдержать в течении ночи в холодильнике 2. осадить 1.5 мл ночной культуры, отмыть осадок в 0.5 мл Т1, осадить, тщательно слить осадок 3. ресуспендировать в 0.04 мл Т2 4. в чистые эппендорфы 0.06 мл Т3, к ним смесь Т2+культура и сразу (с минимальным ресуспендированием) переносить в колодцы в агарозе 5. последовательно наслоить Т4 и Т5 по 0.1 мл, запаять агарозой 6. вгонка в течении 1 часа при небольшом напряжении (подбирать надо для своих условий: имеют значении и параметры камеры и температура и агароза) и форез (опять же под ваши условия) Т1: стандартный ТЕ Т2: сахароза 5%; фиколл 15%; в полукратном ТВЕ Т3: сахароза 5%; Фиколл 15%; РНКаза 20 мкг/мл; лизоцим 0.5 мг/мл (перед использованием); в полукратном ТВЕ Т4: SDS 1%; фиколл 10%; в полукратном ТВЕ Т5: SDS 1%; фиколл 5%; в полукратном ТВЕ Таким пользуемся мы, но по слухам есть новые варианты. Том1 упоминал, что есть современные варианты Экхардта на порядок продвинутые, но ссылку не дал. Может Вам повезет и к Вам он будет более милостлив - спросите. Если Вам в руки попадет метод лучше - поделитесь и Вам воздастся. А жадине-говядине Тому1 не будет райских кущ на том свете за его жадность! Удачи! |
Lec |
|
borigv Постоянный участник г. Саратов |
|
Rhizon Участник |
Форез - горизонтальный. Агароза - 0.7% + 0.4% SDS. Лизирующий буфер - 20% (w/v) сахароза на TBE 1x, + лизоцим (концетрация в зависимости от активности препарата), РНК-за. Ночную культуру, выращенную на TY среде с хлористым кальцием, пересеваете в свежую питательную среду TY (до появления различимой глазом мутности) и инкубируете при 220 rpm 28 C еще 2 часа (время имеет большое значение). Инкубируете при +4 С еще пол-часа (без встряхивания), откручиваете примерно 500 мкл культуры, осадок быстро ресуспендируете в 30 мкл холодного лизирующего буфера и вносите в гель. Ждете 5-10 минут до просветления лизата, далее префорез при 0.5-1 в/см в течение 30 мин, далее - разделение при 3-5 в/см еще 10-15 часов. Окрашиваете и фотографируете. Таким способом Вы сможете разделить даже мегаплазмиды ризобий (две мегаплазмиды S.meliloti, каждая около 1500 kb, видны как две раздельные полосы). Есть публикации о разделении плазмид (включая мегаплазмиды ризобий) с помощью пульс-фореза. Мне кажется, что на сайте, с геномом S.meliloti, http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/an...bacteria/rhime/ приведена именно такая фотография. Вообще, должен предупредить, что метод этот довольно капризный. Один из самых важных моментов - инкубация и пересев. Кроме того, как написал Borgiv, может быть полезно гель перед форезом подержать сутки в буфере, хотя, кажется, необходимость этой стадии может быть связана с маркой агарозы. [ 16.02.2005, 21:51: Сообщение отредактировано: Rhizon ] |
borigv Постоянный участник г. Саратов |
Меня очень заинтересовала Ваша методика, для блоттинга мы ставим также горизонтальный форез на ТАЕ. У меня возникло несколько методических вопросов: зачем выдерживать культуру перед форезом в холодильнике; запаиваете ли Вы лунки перед форезом; не слышали ли Вы об использовании Вашей методики для других бактерий (я хочу попробовать адаптировать ее для себя)? Заранее благодарен, Игорь |
Rhizon Участник |
Конечно, вид микроорганизма очень важен. Например, для E.coli Вы можете и не трудиться с пересевами, делать лизат сразу из ночной культуры (или даже из колонии, взятой с твердой среды). А вот с ризобиями так не выйдет. Вертикальный форез и запаивание лунок Вы делаете потому, что Ваша схема предполагает вхождение SDS в лизат из верхнего слоя, который нельзя разрушать. Мы упрощаем эту стадию, SDS входит в лизат из геля при префорезе, и поэтому в запаивании лунок нет нужды. Стадия с холодильником не слишком обязательна, однако это иногда бывает удобно по техническим соображениям - Вы можете сделать перерыв на пол-часа или более. Кстати, для длинных форезов не хватает буферной емкости TAE 1x, поэтому для Экхардта мы предпочитаем TBE. Метод можно использовать и для других видов бактерий, однако, придется делать какие-то модификации. |
Lec |
|
borigv Постоянный участник г. Саратов |
Уважаемый Rhizon, мы ставим форез на ТАЕ только ради гибридизации, наша система чувствительна к бору, во всех остальных случаях ТВЕ. При этом мы не наслаиваем буферы с SDS в карманы, а заливаем полоску содержащию этот детергент выше карманов. Но Ваши результаты меня очень впечатлили. К сожалению наш способ горизонтального фореза более капризен чем вертикального, а усовершенствовать надо (для нас важно показывать какова локализация генов в геноме), Вы после внесения пробы в гель гоните форез сразу или даете постоять, буфер гель покрывает или вровень? |
Rhizon Участник |
|
MariiaCh |
Скажите, пожалуйста, вы ещё занимаетесь постановкой этого метода, можно с вами проконсультироваться по поводу методики? Подскажите, пожалуйста, толщину геля при проведении горизонтального фореза по Экхарду (имеет ли она значение), форма лунок (широкие/узкие)? При проведении Экхарда у меня не получается получить полосы плазмид, вместо них однородные шмеры ДНК (если необходимо могу прислать фотографию), может ли это быть связано с некорректно проведенным лизисом (много лизоцима - 2 мкг на 500 мкл лиз. буф. или долго лизируется 10 мин), или поломка ДНК может происходить при ресуспендировании в лизирующем буфере (мешаю двумя нажатиями носика автоматической пипетки). (Моя методика, в целом, совпадает с описанной Rhizon, но гель 0,6% и SDS 0,2%) |
Rhizon Участник |
Экхардт все еще актуален (на самом деле, хороший метод), мы его до сих пор используем. Вы не написали самого главного, какие у Вас микроорганизмы и какого размера плазмиды. |
MariiaCh |
Мы работаем на ризобиях. Разделить надо две мегаплазмиды (около 1500 тпн) и криптические плазмиды (100-500 тпн). |
Rhizon Участник |
(я полагаю, что Вы имеете в виду Sinorhizobium), то разделить их будет непросто, хотя и возможно. А Вы подращивали культуру (см. протокол выше)? Это - существенный момент. |
MariiaCh |
Основная задача - получить полосы криптических плазмид. Но если с мегаплазмидами тоже получится, будет великолепно. |
Rhizon Участник |
В общем, и посоветовать нечего, разве что, пригласить в СПб, поставить у нас. |
MariiaCh |
|
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |