molbiol.ru -> Проблемы при секвенировании

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Проблемы при секвенировании -- гетерогенная матрица или шум? --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

mlog
Постоянный участник

08.08.2006 17:11

URL #1

Уважаемые участники!
Третий раз пытаюсь секвенировать один и тот же ПЦР-продукт

Сотрудники центра по секвенированию в первый раз сказали, что матрица нормальная, но слишком низкая концентрация, я повысила концентрацию и снова отдала. Во второй раз они предположили, что амплификат недостаточно очищен, я очистила (элюцией из геля) --- и снова неудача. В третий раз они уже ничего не сказали, только руками развели в недоумении.

Я сама секвенированием не занимаюсь, поэтому не могу понять, что на хроматограмме --- шум или всё-таки попытка прочтения моего образца. BLAST, естественно, никаких гомологий не находит.
Файл с хроматограммой тут: http://www.mccme.ru/~mlog/74_G187_035.ab1

Может, у кого-нибудь есть идеи, в чём проблема и как с ней справиться.

petr
Постоянный участник

08.08.2006 17:27

URL #2

Я Вам все написал в личку.

Anubis

Владивосток

09.08.2006 11:08

URL #3

2 Petr. Может выложите то, что написали в общий форум, а то у меня, в свое время, была подобная ситуёвина.

Ольга Л.

09.08.2006 12:26

URL #4

Похоже на сиквенс с двух матриц одновременно. У Вас ведь сиквенс с ПЦР-продукта голого, продукт не заклонирован? Возможно праймер липнет еще куда-нибудь к середине. А со второго конца тоже самое получается? Выход - заклонировать и секвенировать с плазмиды.

petr
Постоянный участник

09.08.2006 16:04

URL #5

Вот примерно это я и писал, что праймер может липнуть еще куда-то. Чтобы это проверить надо поставить ПЦР с этим праймером, и если продукт поднимется - значит только клонировать и секвенировать с плазмидных праймеров

mlog
Постоянный участник

09.08.2006 18:46

URL #6

petr и Оля Л., спасибо!
действительно с одним из праймеров тоже идёт ПЦР. Но ведь по идее если использовать для секвенирования не этот праймер, а второй, это не должно влиять. Или я не права?

petr
Постоянный участник

09.08.2006 20:30

URL #7

а со второго сиквенс не пойдет, т.к. скорее всего его в ПЦР продукте и не будет
Клонировать прийдется

Сообщение было отредактировано petr - 09.08.2006 20:31

Dimserg
Постоянный участник

10.08.2006 18:42

URL #8

Согласен с petroм: лучше заклонировать и секвенировать с плазмидного праймера. Ваш сиквенс - это действительно демонстративная картинка: "сиквенс сразу с двух матриц", причем на первый взгляд трудно отдифференцировать неспецифику, она по амплитуде ничуть не уступает нужной последовательности (хотя, если захочется заняться извращением......)

Причины могут быть совершенно различными: неспецифический отжиг праймера на Вашей матрице, наличие второй матрицы (полоски не разошлись в геле), нужно было другое соотношение концентраций праймер/ПЦР-продукт, залипание праймера на себя (дизайн такой был + температура отжига сиквенсовой реакции много ниже таковой при ПЦР этого локуса), наличие небольшой делеции (инсерции) в Вашей последовательности сразу после 3'-конца праймера и .т. д. и .т п. Кстати, насчет последнего замечания: конец сиквенса без неспецифики (или интенсивность от одной последовательности стала сильно меньше, чем от другой и уже просто не читается, или один ПЦР-продукт именно на столько короче другого). Убрав последние ааа, которые могла навесить обычная Так-полимераза (если другую используйте - не убирайте) и закинув в бласт, можете получить совпадающие олиги из 17-18 нуклеотидов (из 20 bp конца сиквенса). Впрочем, это все из разряда тех же извращений - полной гомологии нигде нет, организмы совсем разные (я же не знаю, кем Вы занимаетесь).....Так что клонировать, затем секвенировать.

guest: avial
IP-штамп: froLOOvyV3Njo
гость

21.08.2006 16:01

URL #9

Давно уже писал тут по поводу пустых сиквенсов, сиквенсы с плазмид вроде наладились, но недавно отдали на сиквенс ПЦР-продукт, чищенный, концентрация достаточная, праймеры чищенные, ПЦР с геномки идет без неспецифики (вроде больше нигде праймеры не залипают), но с любого из трех праймеров сиквенса нет вообще. Как будто воду отдаем. Выходят пики красителей и дальше ноль. Ставили и с прямого праймера и с обатного и синтезировали сиквенсовый внутри ПЦР-продукта с характеристиками максимально близкими к Т7 (с ним проблем нет, если с клонов) - и ничего. Ставили даже сами сиквенсовую ПЦР на разных температурах отжига - тоже ноль. Впечатление, что не идет именно она. А как ее можно проверить?
В какую сторону копать?
Сиквенатор бекмановский.

petr
Постоянный участник

21.08.2006 17:36

URL #10

А в чем растворяете ПЦР-продукт? И как чистите? Если растворяете в ТЕ, то реакция может и не пойти изза ЕДТА.

Сообщение было отредактировано petr - 21.08.2006 17:36

guest: avial
IP-штамп: froLOOvyV3Njo
гость

21.08.2006 17:51

URL #11

Чистим на колонках - аналог киагеновских (V-gene вроде зовутся). Растворяем в воде, продукт отдаем свежий (т.е., чистим сразу после ПЦР и сразу же на сиквенс после проверки концентрации).
В общем, напрягает именно полный ноль. Ну ладно, шум, грязь и т.д., но впечатление, что реакция не просто не идет, а ингибируется. Не может же она со всех праймеров вообще не проходить.
Обычная ПЦР на чищенном продукте идет нормально.

petr
Постоянный участник

21.08.2006 18:11

URL #12

Все же попробуйте почистить продукт из фореза. И чем нибудь другим.

avial
Постоянный участник

21.08.2006 20:18

URL #13

А колонки большую роль играют?
Бывают такие, после которых результаты ухудшаются?
Проблема в том, что системы не видно. Потому что часть все-таки идет (с плазмид и ПЦР с плазмид, но с Т7), а часть (обычные ПЦР с геномки) - нет.

petr
Постоянный участник

21.08.2006 21:39

URL #14

Да, колонки могут сделать гадость. Плохо если они старые. У меня был случай, когда плазмида выделенная на одних колонках не трансфецировалась

avial
Постоянный участник

22.08.2006 00:32

URL #15

Угу, старые...
Попробую китом ферментаса, как раз пока новые промеговские подвезут. Сравню результаты.

petr
Постоянный участник

22.08.2006 01:59

URL #16

Можно вообще попробовать выделить перемораживанием, а потом переосадить. Промеговскими я не пользовался, ничего не могу сказать. Пользую колонки от ZymoResearch (DNA gel recovery kit), они мне очень нравятся, к тому же там можно элюировать фрагмент в 5-6 мкл, чего не получится с другими колонками. Кстати, это еще и один из наиболее дешевых и реально работающих китов.

Atropos
Постоянный участник
abroad

12.10.2006 01:32

URL #17

(petr @ 22.08.2006 02:59)

Пользую колонки от ZymoResearch (DNA gel recovery kit), они мне очень нравятся, к тому же там можно элюировать фрагмент в 5-6 мкл, чего не получится с другими колонками. Кстати, это еще и один из наиболее дешевых и реально работающих китов.

Интересно, а в России он продаётся где-нибудь?

LMP
Постоянный участник

15.10.2006 23:50

URL #18

Genomed для этих целей вполне подходит. В Химмеде продается.

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

16.10.2006 16:03

URL #19

можно добавить по буковке на 3' праймера и сделать несколько сиквенсов -какой
понравится тот и брать

Guest
IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2
гость

16.10.2006 16:17

URL #20

1: Nucleic Acids Res. 1999 Oct 1;27(19):e28.Click here to read Click here to read Links
Direct sequencing of RAPD fragments using 3'-extended oligonucleotide primers and dye terminator cycle-sequencing.

* Mitchelson KR,
* Drenth J,
* Duong H,
* Chaparro JX.

ForBio Research Pty Ltd, 52 Douglas Street, Milton, Queensland 4064, Australia. keithmitchelson@hotmail.com

Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers are used widely to develop high resolution genetic maps and for genome fingerprinting. Typically, single oligomers of approximately 10 nucleotides are used to PCR amplify characteristic RAPD marker fragments. We describe an efficient method for the direct end-sequencing of gel-purified RAPD fragments using one primer from a set of four 3'-terminal extended (A, T, C or G) oligonucleotides, identical to the RAPD primer but for the single nucleotide extension. Strand-specific DNA sequence could be independently read from each of the RAPD fragments without recourse to strand separation or fragment cloning. Informative RAPD fragments could be readily converted into mapped STS or SCAR loci using this technology. The 3'-extended primers may also be used to amplify independent genomic RAPD markers.

hy
IP-штамп: frAb3o0RKCWrg
гость

18.02.2021 08:12

URL #21

AVG Retail is the best Antivirus programming which is accessible on avg.com/retail , gives the total suite of highlights which can http://avg.com-retail.net verify your computerized on the web and disconnected work of the framework or gadgets.

jonsonmark581
Постоянный участник

22.02.2021 09:16

URL #22

Hulu.com/activate - To activate Hulu on new gadgets or computers you need to login to your Hulu account at www.hulu.com/activate and enter the activation code Hulu. On the off chance that you do not have to face any issues in Hulu records or hulu activation code volume, you can contact the retention group Hulu for complete direction.

www.hulu.com/activate
hulu activation code
hulu.com/activate
www.hulu.com/activate enter code

jonsonmark581
Постоянный участник

22.02.2021 09:29

URL #23

Through www.amazon.com/mytv - how you can connect your mobile phone to Amazon Prime. Through amazon.com/mytv, you can watch your favorite TV shows, series movies. You can watch prime videos anywhere on your device. Users need to create an Amazon account if they don’t have an Amazon account and enter the Amazon my TV activation code to watch Amazon prime videos on your device.

www.amazon.com/mytv
amazon.com/mytv
www.amazon.com/code
Amazon Activation Code

jonsonmark581
Постоянный участник

22.02.2021 09:34

URL #24

Throughout the long term, Roku has become tremendously common and by and large believed to be as perhaps the most excellent streaming techniques all around the world. By linking remotely to your fast Internet link, www.roku.com/link web based entertainers let you to show the motion pictures, TV shows and music to your televisions. With over numerous channels of the broadcasting content that is likewise changed for survey on a bigger screen.

www.roku.com/link
roku.com/link
roku link code
www.roku.com link

Stephen Nicolas

04.03.2021 17:25

URL #25

This website is only a guide for users to understand the process to Download, Install and Activate Webroot Products, We do not have any affiliations from Webroot.com/safe and any other company related to Antivirus. Do you wish to browse the web without worrying about any cyber threats? Undoubtedly, technology is a powerful thing that has made everything possible and easy for us. But, on the other hand, it can be harmful as well if we don’t take the precautions to keep our devices and their data safe. So, what can one do to protect their devices and data from all cyber threats? Well, the answer is obvious.

watchesbiz
Постоянный участник

28.09.2021 05:09

URL #26

https://www.uptrennd.com/post-detail/hints-...-watch~ODY3MDU2
https://anotepad.com/note/read/mqg8p5jm
https://www.crokes.com/replicarolexwatches/profile/
https://ko-fi.com/post/Watches-Shopping-Gui...-Watc-E1E13PZV9
https://www.merchantcircle.com/blogs/replic...x-Watch/1966540
https://www.nairaland.com/6427528/watches-s...de-finding-fake
https://www.vingle.net/posts/3587193
https://fortunetelleroracle.com/sport/replica-watches-280478
https://www.goodreads.com/story/show/132736...ake-rolex-watch
https://www.diigo.com/item/note/85twz/phwr?...2395edb2dac07ea
https://github.com/ReplicawatchesUK/Replica...ake-Rolex-Watch
https://www.reddit.com/user/Bestreplicawatc...ke_rolex_watch/
https://slashdot.org/submission/13306958/wa...ake-rolex-watch
https://www.wattpad.com/1030107359-replica-...guide-finding-a
https://www.instructables.com/member/Fakero...licPreview=true

watchesonline89
Постоянный участник

24.12.2022 12:02

URL #27

https://omegawatches89.mystrikingly.com/
https://www.deviantart.com/omegawatches89/j...pular-930508248
https://eatsleepride.com/c/383270
https://fortunetelleroracle.com/fashion/ama...s-online-737627
https://www.intensedebate.com/people/omegawatches89
https://fortunetelleroracle.com/fashion-acc...-popular-737613
https://anotepad.com/notes/ykiydhnj
https://medium.com/@omegawatches89/amazing-...ne-b4863ed55af0
https://omegawatches90.mystrikingly.com/
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/repli...ve-items-online
https://62e8da780bf7c.site123.me/
https://padlet.com/omegawatches89/9ibenzfwbcer7k71
https://omegawatches89.simplesite.com/452939012
https://62e8da780bf7c.site123.me/blog/excit...-replica-online
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/advan...replica-watches

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.