Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* need help with PCR
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! shinavn




 прочитанное сообщение 20.06.2019 05:02     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Здравствуйте,

Я пытаюсь оптимизировать ПЦР с праймерами, у которых комплементарный участок 20 бп и оверханг 60 ("адаптер"). Без адаптеров ПЦР работает прекрасно, нет неспецифики на геномке. Когда я пытаюсь повторить то же самое но с длинными праймерами ПЦР не идет совсемfrown.gif Праймеры остаются неизрасходованными (сингл-странд), ПЦР продукта они не образуют. Я попыталась снизить температуру отжига с 60 до 55, еффект тот же. И попробовала первые 4 цицла на 55 и оставшиеся на 72 (Тм праймера с адаптером 78), не помогло.
Вторичные структуры для праймеров образуются при температурах ниже 55, и не закрывают часть комплементарную ДНК.

но может кто-нибудь подскажет альтернативный вариант?
Участник оффлайн! MMM
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.06.2019 06:47     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Интересно, вы сами такой изврат придумали или вам кто-то посоветовал. Не получицца!!!!

Не очень понятно зачем и к чему такие "адаптеры" длинные.

Альтернативы я вижу две.

Первая
Вы делаете несколько последовательных ПЦР с серией праймеров длиной не более 30 . Каждый раз последовательность праймеров должна смещаться все дальше по последовательности адаптера и при этом иметь в составе однонитевое продолжение последовательности.

Вторая
Вы делаете ПЦР с нормальными праймерами, с которыми она у вас идёт. Потом для порядку чистите полученный фрагмент электрофорезом.

И далее делаете как бы один цикл с длинными адаптерами. Т. е. Денатурируете фрагмент, добавляете длинные праймеры("адаптеры") и отжигаете при низкой температуре (градусов 40 , минут 15-20) затем добавляете полимеразу и нуклеотиды и достраиваете фрагмент при 72 градусах тоже минут 5-10. Эту историю проще вообще делать не в циклере, а в простом термостате.
Потом берете из этой пробирки небольшую аликвоту и с ней делаете ПЦР с короткими праймерами к концевым последовательностям "адаптеров"
Участник оффлайн! Asterix
Участник



 прочитанное сообщение 20.06.2019 14:34     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

Ну в принципе правильно сказали , берете свой ПЦР продукт с короткими праймерами в качестве матрицы и на нем уже ПЦРите с длинными. И все будет ...

Ну а напрямую с геномки тоже можно , ничего особо страшного в этом нет , надо просто добавить ДМСО , 5% скажем... и взять другую полимеразу, ну и хотстарт обязательно.

делайте 54-72-94, и не мучайтесь с подбором температуры отжига , это самое последнее о чем надо думать.

Ну и я так понимаю новые праймеры вам не хочется делать , но на будущее в такой ситуации минимум 25 нуклеотидов делайте комплиментарную матртице область. А лучше все 30. Это сгладит кучу возможных осложнений в реакции
Участник оффлайн! Carbon Copy
Постоянный участник
So close no matter how far



 прочитанное сообщение 20.06.2019 16:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

Я думаю, что ПЦР у Вас идёт с очень низкой эффективностью и поэтому Вы не видите фрагментов, так как их мало. Проще всего будет ничего не менять, а поставить вторичную ПЦР с праймерами, комплиментарными к овехэнгам.

Всего благодарностей: 2Поблагодарили (2): Asterix, Кузбассовец
Участник оффлайн! -Ъ-
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 20.06.2019 19:37     Сообщение для модератора         Личное письмо
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

Отжиг наоборот повышайте сколько еще позволяют 20 нт, но самое главное надо повысить ВРЕМЯ на отжиге в два-три раза (до минуты) на первых 4-5 циклах.
А далее по программе 72-95 град. делайте то же количество циклов, что было с "нормальными" праймерами. Все должно быть ОК, по своему опыту.

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Asterix
Участник оффлайн! tipisev




 прочитанное сообщение 21.06.2019 22:29     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

(-Ъ- @ 20.06.2019 20:37)
Ссылка на исходное сообщение  Отжиг наоборот повышайте сколько еще позволяют 20 нт, но самое главное надо повысить ВРЕМЯ на отжиге в два-три раза (до минуты) на первых 4-5 циклах.
А далее по программе 72-95 град. делайте то же количество циклов, что было с "нормальными" праймерами. Все должно быть ОК, по своему опыту.

umnik.gif beer.gif

60 оверханг Иллумина шоли lol.gif lol.gif

  наскока помню 60 бп оверханг это 16с микробиом на иллумине  eek.gif  confused.gif  eek.gif  confused.gif
сделай короткий оверханг на основной пцр потом добав 3 цикла 60 бп

ваамсчето делал лимон раз 60 нт оверханги Проблем небыло eek.gif confused.gif
Участник оффлайн! kenseq
Участник



 прочитанное сообщение 09.07.2019 00:21     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

(shinavn @ 20.06.2019 06:02)
Ссылка на исходное сообщение  
Вторичные структуры для праймеров образуются при температурах ниже 55, и не закрывают часть комплементарную ДНК


вот тут поподробней про вторичные структуры lol.gif lol.gif beer.gif beer.gif jump.gif jump.gif jump.gif
Участник оффлайн! kenseq
Участник



 прочитанное сообщение 09.07.2019 00:27     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

выложите ваш куев праймер smile.gif
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 09.07.2019 12:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

(shinavn @ 20.06.2019 03:02)
Ссылка на исходное сообщение  Здравствуйте,

но может кто-нибудь подскажет альтернативный вариант?

А вы можете для начала описать конечную цель того, что Вы делаете и что хотите получить?

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): kenseq
Участник оффлайн! kenseq
Участник



 прочитанное сообщение 14.07.2019 20:39     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

(ship @ 09.07.2019 13:49)
Ссылка на исходное сообщение  А вы можете для начала описать конечную цель того, что Вы делаете и что хотите получить?

smile.gif beer.gif beer.gif
шип я пцрил такие оверханги толко на микробиом 16S Illumina MiSeq smile.gif

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 23.07.19 05:10
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft