Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Щёлкните, чтобы внести в Избранные Темы* CRISPR-Cas9 -- запутался в трех соснах --
ИнтерЛабСервис - передовые технологии молекулярной диагностики
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.


 
Добавить сообщение в темуСоздать новую темуСоздать голосование
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.10.2016 14:41     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #1 множественное цитирование

Вводная:
Делаю лентивирусы, экпрессирующие Cas9 и гайдРНК. Плюю их на человеческие клетки и смотрю на вестерне экспрессию целевого белка. Уменьшение есть, но хочется иметь полный нокаут. Клетки позитивные на инфекцию отбираю на пуромицине.
Что бы разобраться в эффективности нокаута делаю Т7 мисматч тест. Вроде инделы есть.
Вопрос:
Хочу сделать клональную селекцию после инфекции. Как отбирать наилучшие клоны? Только Вестерном? Ведь в геноме две копии хромосомы и соответственно две копии моей мешени. Если нокаут идет только по одной хромосоме, то на сиквенсе сенгером я получи кашу от разных аллелей. Это если сразу сиквенировать участок в окрестностях мешени. А если сначала клонировать фрагменты ПЦР то на сиквенсе в разных бактериальных клонах будут разные аллели.
Как подбирать праймеры для ПЦР, что бы разобраться в разных вариантах:
1. Нет нокаута целевого гена (или есть оффтагет эффект)
2. Нокаут только по одной аллели
3. Полный нокаут. Как я понимаю у каждой аллели можент быть свой набор инделов.
Вариантов полногеномного сиквенирования не предлагать. Это, безусловно, информативно, но уж больно дорого.
Участник оффлайн! Serpent
Постоянный участник
RU-->IT



 прочитанное сообщение 19.10.2016 17:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #2 множественное цитирование

Можно отбирать клоны на основе ПЦР с геномной ДНК.
При этом можно подобрать 2 гРНК так, чтобы 2 разрыва приводили к делеции достаточно большого куска днки, чтобы разницу видеть на форезе.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 19.10.2016 17:52     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #3 множественное цитирование

при выборе двух sgRNA для делеции большого куска у вас будут клоны без делеции, с моноаллельной делецией и делецией во обоих аллелях. затем нужный выбираете ПЦРом.

стр2287

Файл/ы:

скачать файл Ran_FA_Nat_Protoc_2013.pdf
размер: 1.67мб
кол-во скачиваний: 179




Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): NMR-guy
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.10.2016 17:56     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #4 множественное цитирование

(Serpent @ 19.10.2016 15:05)
Ссылка на исходное сообщение  Можно отбирать клоны на основе ПЦР с геномной ДНК.
При этом можно подобрать 2 гРНК так, чтобы 2 разрыва приводили к делеции достаточно большого куска днки, чтобы разницу видеть на форезе.

А можно схемку нарисовать? Как то не совсем понятно как большая делеция получается.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 19.10.2016 18:03     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #5 множественное цитирование

(Sergeant @ 19.10.2016 15:56)
Ссылка на исходное сообщение  А можно схемку нарисовать? Как то не совсем понятно как большая делеция получается.

см статью выше
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.10.2016 18:05     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #6 множественное цитирование

(ship @ 19.10.2016 16:03)
Ссылка на исходное сообщение  см статью выше

Спасибо
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 19.10.2016 20:50     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #7 множественное цитирование

Вроде начинаю понимать. Для большой делеции нужно брать никазную D10A версию Cas9 и два гайдРНК, которые берем в противоположных ориентациях.
С ПЦР все ясно. Праймеры фланкирующие делецию или комбинации out/in.
В моем случае в линтивирусе Cas9 дикого типа и только одна гайдРНК.
Ну Cas9 я легко поменяю мутагенезом, а что делать со второй РНК? Делать два разных вируса и коинфекцию? Слишком много новой возни. В моем случае делеции получаются небольшие и внутренних праймеров на них не сделать, а внешние дают продукт, который не разделится на агарозе, а городить длинные акриламидные гели геморой.
Начинаю завидовать владельцам сиквенаторов от Иллюмины. smile.gif РНК-сек и баркодинг были бы в тему.
Куда не глянь, а в моем случае самое простое/дешовое делать скрининг Вестерном.
Участник оффлайн! ship
Постоянный участник
Moscow



 прочитанное сообщение 19.10.2016 23:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #8 множественное цитирование

ну у вас все вроде понятно - если белка нет - то два аллеля порезано, хорошо что можно блот делать.
а потом уже можно клоны и от ПЦРить и секвенировать по Сэнгеру, чтобы убедится.
по идее можно сделать один праймер на место делеции, другой внешний - с дикого типа и с одного аллеля будет ПЦРится, а если оба аллеля порезаны - то нет.
Участник оффлайн! Flyamer
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 20.10.2016 14:59     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #9 множественное цитирование

Если не вестерн и не next gen seq, то только клонирование ПЦР-продукта и секвенирование клонов, ИМХО. А вот если делать не просто разрез, а еще и делать HDR, то можно просто секвенировать ПЦР продукт, потому что тогда в случае разреза и починки на обоих хромосомах последовательность будет одинаковая.

Плюс есть вот эта штука, которая может решить все проблемы, но я не пробовал.
https://tide.nki.nl/

Всего благодарностей: 1Поблагодарили (1): Sergeant
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 20.10.2016 17:09     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #10 множественное цитирование

Плюс есть вот эта штука, которая может решить все проблемы, но я не пробовал.
https://tide.nki.nl/

Ценник впечатляет. И как то я сомневаюсь , что эта штука вообще может взлететь.
Но ПОПРОБУЮ.
то только клонирование ПЦР-продукта и секвенирование клонов

Пробовали. Теоретически Да. А практически нужно иметь целый взвод негров для клонирования и скрининга. Плохо масштабируемо. frown.gif
С клональной селекцией тоже не так уж радужно. Долго. И не все клетки так резво делятся как 293.
Участник оффлайн! Flyamer
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 21.10.2016 12:18     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #11 множественное цитирование

Какой еще ценник? Это бесплатная штука (онлайн которая).

Причем здесь 293? Е. коли быстро делятся smile.gif

Сообщение было отредактировано Flyamer - 21.10.2016 12:20
Участник оффлайн! Sergeant
Постоянный участник



 прочитанное сообщение 21.10.2016 14:13     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #12 множественное цитирование

(Flyamer @ 21.10.2016 10:18)
Ссылка на исходное сообщение  Какой еще ценник? Это бесплатная штука (онлайн которая).

Причем здесь 293? Е. коли быстро делятся smile.gif

1. Ну это я про лицензию для желающих прикрутить R скрипты на свой веб сервер.
Меня и бесплатный вариант устроит. Вот только есть небольшая проблемма.
Программа не работает ни с одного рабочего места. Серый экран и никаких признаков жизни. Пробовал дома. Там работает. lol.gif
2. А причем здесь E.Coli? Я вроде бактериальный геном редактировать не собираюсь. Клонирование понятие универсальное. Бактериями не ограничивается.
В моей ситуации я плюю вирус на человеческие клетки. Потом давлю антибиотиком неифецированные клетки. Что получается? Получается компот из гомозиготных, гетерозиготных нокаутов. Плюс варианты с делециями, но активным белком. Плюс неспецифика. На вестерне в сумме все это дает падение экспессии до 30-50%. Меня КАТЕГОРИЧЕСКИ не устраивает.
Выход из ситуации- рассадить инфецированные клетки в 96 велочный планшет примерно по одной клетке на лунку. И ждать пока в лунках вырастут клоны. Если клетки шустро делятся тогда за 2-3 недели можно наростить клеток до товарного колличества и делать скрининг на этих клонах. А если клетки дохлые и ростут очень медленно, то до клонов можно и не дожить.
Участник оффлайн! Flyamer
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 22.10.2016 01:31     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #13 множественное цитирование

Да, они там пишут на сайте где-то, что бывают проблемы с доступом из-за фаерволов...

Да это я понимаю, что универсальное. Но ведь клонировать ПЦР-продукт из человеческих клонов надо будет в е коли, чтобы потом секвенировать. А то если в двух аллелях по-разному починился разрыв, опять же будет мешанина в сиквенсе.

Сообщение было отредактировано Flyamer - 22.10.2016 10:48
Участник оффлайн! Esya
Постоянный участник
PA, USA



 прочитанное сообщение 22.10.2016 03:32     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail  Web-адрес  ICQ
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #14 множественное цитирование

Но ведь клонировать ПЦР-продукт из человеческих клонов надо будет в е коли, чтобы потом секвенировать.

а зачем?
Участник оффлайн! Flyamer
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 22.10.2016 10:49     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #15 множественное цитирование

(Flyamer @ 22.10.2016 02:31)
Ссылка на исходное сообщение А то если в двух аллелях по-разному починился разрыв, опять же будет мешанина в сиквенсе.
Участник оффлайн! Flyamer
Постоянный участник
Москва



 прочитанное сообщение 22.10.2016 11:30     Сообщение для модератора         Личное письмо  Отправить e-mail
Цитировать Поместить сообщение в колонку новостей  URL #16 множественное цитирование

А в G2 в клетке хоть все 4 копи могут по-разному починиться, это совсем непойми что будет.

Конечно, может, этот TIDE все разберет, тогда это не нужно.

*




Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.
Имя:

 преобразовывать смайлики · показать смайлики
Назначение кнопок:

   Поблагодарить автора сообщения — поблагодарить автора
   Удалить сообщение — удалить
   Редактировать сообщение — редактировать
   Поместить сообщение в колонку новостей — поместить в колонку новостей
   Цитировать — цитировать сообщение
   не входит в цитирование/входит в цитирование — цитировать несколько
   Отметить СПАМ-сообщение — обозначить спам
   Сообщение для модератора — связь с модератором
   Участник онлайн!/Участник оффлайн! — автор онлайн/оффлайн
   Фотография — фотография автора

   - остальные обозначения -
 
   *
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема »
Быстрый ответДобавить сообщение в темуСоздать новую тему

Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 22.02.20 13:35
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft