molbiol.ru -> Выделение ДНК Myc. tuberculosis

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Выделение ДНК Myc. tuberculosis -- ГТЦ и магносорбенты --

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

bpevhel

15.05.2014 10:47

URL #1

Моя задача - подобрать условия для выделения ДНКи, выигрывающие по чувствительности в сравнению с набором Promega. Лизирующий буфер готовила по рецепту:

GuSCN - 120g
Tris hydrochloride - 0.1 M 100 ml
EDTA - 0.2 M
Triton X-100 - 2.6 g
HCl - доводила до pH-8

Такой же pH в растворе (EDTA и азид Na) с магносорбентами.

Пока проигрыш перед Promega на 3-5 циклов - много! ДНК теряется. Подскажите пожалуйста, как можно модифицировать лизирующий или, может быть, кому-то по секрету известен его состав от Promega?

Pit

Москва

15.05.2014 12:53

URL #2

А Вы уверены, что дело именно в лизисе? В смеси тритона с гуанидином лизируется все живое, насколько мне известно. Для верности можете еще и погреть это дело, градусах эдак на 90-100 минут 10, тогда уж точно ни единой клеточки целой не найдете.

Я бы копал в сторону отмывок, большинство потерь именно там происходит. И не забывайте, что гуанидин сильнейший ингибитор ПЦР, так что если отмывка недостаточно эффективна, вы всегда будете лихо терять в чувствительности.

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

15.05.2014 13:34

URL #3

Пока для меня остается загадкой, как в декларируемом буфере рН к 8 можно подводить кислотой. Разве что ЭДТА у вас тетранатриевая соль. Не вижу смысла в таком количестве ЭДТА и тритона. А ГТЦ можно и чутка взять поболе.

ship
Постоянный участник
Moscow

15.05.2014 13:44

URL #4

вы выход днк все таки не в циклах, в мкг пишите.
и вот чтото мне кажется, что уже лет 10-20 назад вопрос выделения днк из микобактерий для последующего проведения ПЦР был уже решен.

bpevhel

15.05.2014 15:28

URL #5

Благодарю всех за советы!

Pit. Пока дополнительная отмывка результат не улучшила. Попробую еще повторы, может, и правда.

МММ. Нашла рецепт: ЭДТА уменьшить до 0.02 М и Triton - раза в 2-3 - так корректнее?

Ship, вопрос выделения решен с использованием буржуйских наборов, а мне надо свое, при крайне малом количестве агента в биоматериале (мокрота, лаваж).

ship
Постоянный участник
Moscow

15.05.2014 15:38

URL #6

да причем тут буржуйские наборы? в России все это давно ПЦРят и все выделяют доморощенными реагентами, навскидку хотя бы у Литеха есть такие наборы, копеешной стоимости.

Esya
Постоянный участник
PA, USA

15.05.2014 15:45

URL #7

переформулируйте задачу, пожалуйста... так что вам надо, больше днки, чище, или быстрее из многих образцов??
или нужен стандартный метод, чтобы можно было даже мою маму взять на работу днк чистить?

bpevhel

15.05.2014 15:51

URL #8

Нужно снизить потери той, что есть, с использованием своего набора. Доморощенными выделяют, только вот их эффективность при работе с клиническими образцами различается.

Esya
Постоянный участник
PA, USA

15.05.2014 16:00

URL #9

вот я и спрашиваю, почему эффективность отличается? из-за чистоты или количества, причем, слишком много тоже плохо, кстати

вот над этим и подумайте

бесколоночный метод никогда вам не даст такой же воспроизводимости как набор с колонками

Поблагодарили (2): -Ъ-, bpevhel

ship
Постоянный участник
Moscow

15.05.2014 16:07

URL #10

(bpevhel @ 15.05.2014 13:51)

но и сами клинические образцы всегда различаются по количеству материала, ибо все пациенты разные, забор производят разные люди и тп.

ну сделайте в протоколе поболее циклов в чем проблема?
у набор на что расчитан? количественное определение или есть-нет?

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

15.05.2014 17:20

URL #11

Задача перед Вами хорошая, но рецепт странный. И до какой же метки доводили водой??? А магносорбент с чем на поверхности (имею ввиду функциональную группу). Не слышал еще ни разу хвалебные отзывы на ДНК преп киты от Промеги.
Да, начальство Ваше я бы уволил за разбазаривание средств по изобретению велосипеда

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

15.05.2014 17:40

URL #12

(Esya @ 15.05.2014 16:45)

Увы, Вашей маме не повезло. Нынче магносорбенты модно на роботах юзать.
И о существовании "качества" препарата пока не догадываются. Речь пока о выходе ДНК в циклах.

-Ъ-
Постоянный участник
Москва

15.05.2014 17:50

URL #13

(bpevhel @ 15.05.2014 16:28)

Ship, вопрос выделения решен с использованием буржуйских наборов, а мне надо свое, при крайне малом количестве агента в биоматериале (мокрота, лаваж).

Тогда работайте над получением лизата, зачем городить огород?

IMK
Участник

22.05.2014 05:56

URL #14

В образцах, где есть МБТ, часто много слизи. Муколитики Вам в помощь.

Поблагодарили (2): ALexx Roms, bpevhel

watchesbiz
Постоянный участник

27.11.2021 16:06

URL #15

https://archives.profsurv.com/forum/Profess...ert/-67881.aspx
https://atlanta.bubblelife.com/community/an...ex_Watch_Online
https://gumroad.com/rolexrelicawatches/p/di...replica-watches
https://onmogul.com/stories/guide-on-how-to...ex-watch-online
https://list.ly/i/5704105
https://www.behance.net/gallery/114237003/Replica-Rolex
https://www.mlbdailydish.com/users/Replicarolexwatches
http://replicawatches24.simplesite.com/
https://watcheshutuk.cabanova.com/
https://www.pinterest.com/watcheshutuk/_saved/
https://www.linkedin.com/pulse/guide-how-pu...online-hei-bai/
https://justpaste.it/8t11q
https://padlet.com/watcheshutuk/in2opwnfmnmclce8
https://www.allforxi.com/users/Replicarolexwatches
https://profile.hatena.ne.jp/Rolexrelicawatches/profile

watchesonline89
Постоянный участник

28.12.2022 10:31

URL #16

https://diigo.com/0pigcp
https://penzu.com/p/847cc342
https://writer.zoho.com/writer/open/k3enw4d...b0a3d8cf13c901a
https://eatsleepride.com/c/383274
https://anotepad.com/notes/byixar75
https://www.deviantart.com/omegawatches89/j...tches-930507835
https://form.jotform.com/223253469189061
https://padlet.com/omegawatches89/fvf9g8yhawsjurox
https://anotepad.com/notes/9393ncw8
https://www.crokes.com/omegawatches89/info/
https://www.merchantcircle.com/omegawatches89-houston-tx
https://trello.com/b/kEnu4Gm0/rolex-replica
https://www.instapaper.com/u
https://form.jotform.com/223253136113039
https://www.pinterest.com/pin/957859414473160488/
https://www.pinterest.com/pin/957859414473160566/
https://www.pearltrees.com/omegawatches89#item456651188
https://plaza.rakuten.co.jp/omegawatches89/...y/202208040003/

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.