Все форумы > Молекулярная и клеточная биология > версия для печати
Web-адрес темы: http://molbiol.ru/forums/index.php?s=1f3c328c2b12047e29a6d91016f12b75&act=ST&f=1&t=533706

Доморощенные магносорбенты

genseq 11.09.2013 20:11
На днях наловчился получать магносорбенты. Пока сделал три варианта:
1. Силикатные.
2. Фосфатные.
3. Цинковые.
С первыми - силикатными - всё более или менее понятно. Нужны для выделения ДНК, и проверка их работоспособности - вопрос времени. А вот зачем могут понадобиться фосфатные? confused.gif Не исключено, что их можно использовать вместо фосфоцеллюлозы. Да и просто в качестве ионообменника.
Цинковые, похоже, нигде пока не используются, но они должны очень хорошо связывать и ДНК, и РНК, и все прочие низко- и высокомолекулярные фосфат-содержащие соединения. Возможно и гистидин-содержащие.

Буду признателен за любые предложения. Если предложения будут не теоретические, а практические (по их испытаниям), то берусь обеспечить и магносорбентами, и магнитными штативами:
http://molbiol.ru/forums/index.php?act=Att...=post&id=181131 ( http://molbiol.ru/forums/index.php?act=Attach&type=post&id=181131 )



comp3v 12.09.2013 07:49
а для пришивания антител никакие из них не подходят? чтобы иммунопреципитацию делать



genseq 12.09.2013 09:17
(comp3v @ 12.09.2013 05:49)
Ссылка на исходное сообщение  а для пришивания антител никакие из них не подходят? чтобы иммунопреципитацию делать


Хорошая идея! Фосфатные должны неплохо сшиваться с аминными группами карободимидом. Только для активации такой сшивки, в отличие от карбоксильных, используется не гидроксисукцинимид, а какая-то другая фиговинкаconfused.gif (забыл название). Связь P-N кислотолабильная, но в обычных условиях вполне стабильная.



comp3v 12.09.2013 13:57
в общем, если удастся такое сделать, было бы вполне востребовано.
Ещё вот, вариация на ту же тему - кобальтовые (Co2+ или Ni2+) магнитные бидсы для выделения His-меченых белков, как альтернатива TALON ( http://www.clontech.com/RU/Products/Protein_Expression_and_Purification/His-Tagged_Protein_Purification/Cobalt_Resin-Magnetic )'у - это вот мы бы хоть прямщас купили.



inview 12.09.2013 15:27
(comp3v @ 12.09.2013 14:57)
Ссылка на исходное сообщение  в общем, если удастся такое сделать, было бы вполне востребовано.
Ещё вот, вариация на ту же тему - кобальтовые (Co2+ или Ni2+) магнитные бидсы для выделения His-меченых белков, как альтернатива TALON ( http://www.clontech.com/RU/Products/Protein_Expression_and_Purification/His-Tagged_Protein_Purification/Cobalt_Resin-Magnetic )'у - это вот мы бы хоть прямщас купили.
Тоже подумал про кобальтовые и никелевые сорбенты, но не для гистидиновых гибридов, а для выделения некоторых металл-связывающих белков из биожидкостей. Такое было бы интересно потестить. Цинк в этом смысле менее подходящ.



comp3v 12.09.2013 15:29
(genseq @ 12.09.2013 15:42)
Ссылка на исходное сообщение  Подозреваю, что His-тэги с цинком будут связываться не хуже, чем с никелем. Эти подозрения вселяют некоторые публикации. Например:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/P.../BCA-02-125.pdf ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2267071/pdf/BCA-02-125.pdf )
хммм, вот тут не уверен. Всё-таки один факт наличия взаимодействия, показанного в статье, вовсе не означает, что это взаимодействие будет достаточно сильным для выделения белков. Да и неспроста, наверное, все производители делают только кобальтовые либо никелевые сорбенты.

Поэкспериментировать - можно попробовать, месяца через полтора планирую снова вернуться к выделениям His-меченых белков. Да, забыл сказать - у меня протокол выделения в денатурирующих условиях (6M гуанидин-хлорид) - выдержат ваши сорбенты такое?



genseq 12.09.2013 16:01
(comp3v @ 12.09.2013 13:29)
Ссылка на исходное сообщение  хммм, вот тут не уверен. Всё-таки один факт наличия взаимодействия, показанного в статье, вовсе не означает, что это взаимодействие будет достаточно сильным для выделения белков. Да и неспроста, наверное, все производители делают только кобальтовые либо никелевые сорбенты.

Поэкспериментировать - можно попробовать, месяца через полтора планирую снова вернуться к выделениям His-меченых белков. Да, забыл сказать - у меня протокол выделения в денатурирующих условиях (6M гуанидин-хлорид) - выдержат ваши сорбенты такое?


Уговорили. Сделаю и никелевые. smile.gif
Сорбенты сферические, но сугубо неорганические. Теоретически гуанидин на них действовать не должен. rolleyes.gif



genseq 12.09.2013 21:20
Цинк связывает His6 лучше никеля в 20 раз!
http://peds.oxfordjournals.org/content/21/8/529.long ( http://peds.oxfordjournals.org/content/21/8/529.long )



Файл/ы:

Скачать файл Fluorescence_imaging_of_His_tag_fused_proteins.pdf
Размер:: 1.87мб
кол-во скачиваний: 273




comp3v 13.09.2013 06:54
ну, вот в этом обзоре ( http://dx.doi.org/10.1016/S0076-6879(09)63027-5 ) по IMAC пишут, что с цинком тоже вполне себе работало, хотя и немного похуже чем с никелем - см. Fig. 27.9



guest: ммм 13.09.2013 07:49
Если вы собираетесь использовать неорганическую матрицу для сорбции белков, моут быть проблемы, как с неспецифической сорбцией, так и с необратимой сорбцией на матрице.



genseq 13.09.2013 07:50
Судя по всему, Zn связывает His6 не хуже (или лучше) Ni, но последний, в отличии от первого, не реагирует на фосфаты (см. табл. 27.2 этого обзора) и на бета-меркаптоэтанол. А цинк, похоже, вяжется и с сульфгидрильными группами, и с нуклеотидами, и с РНК. Т.е. при недостатке сорбента они могут мешать связыванию His6-рекомбинантов и потребуется предварительная очистка. Хотя в обзоре Zn работал очень неплохо. Правда, они чистили белок, содержащий Zn-finger.

104.58к -



Файл/ы:

Скачать файл IMAC_Review.pdf
Размер:: 1.33мб
кол-во скачиваний: 32672




avial 13.09.2013 13:39
А банальные силикатные на пробу поюзать можно для ДНК? Сейчас как раз играюсь с различными типами частиц.



genseq 13.09.2013 17:37
(avial @ 13.09.2013 11:39)
Ссылка на исходное сообщение  А банальные силикатные на пробу поюзать можно для ДНК? Сейчас как раз играюсь с различными типами частиц.


Можно, но не сегодня. Препарат сможете забрать следующей неделе. Явки и пароли передам по E-mail.



avial 13.09.2013 23:48
Спасибо!

В процессе игр выяснил, что в отмывочном буфере Силекса явно содержится что-то типа эфира (по запаху) - а для чего?



genseq 14.09.2013 08:01
(avial @ 13.09.2013 21:48)
Ссылка на исходное сообщение  Спасибо!

В процессе игр выяснил, что в отмывочном буфере Силекса явно содержится что-то типа эфира (по запаху) - а для чего?


Не знаю как у Силекса, но за бугром "отмывочный буфер" - это, как правило, 70% этанол. Вместо этанола можно использовать изопропанол (ИПС), который я покупаю в лакокрасочном отделе хозяйственного магазина и использую вместо этанола на стадии силиконизации магносорбентов. Правда, сейчас ИПС завозить перестали и пришлось перейти на ацетон. Кстати, об ацетоне. Можно попытаться заменить им спирт в отмывочном буфере. shuffle.gif



avial 14.09.2013 23:52
С этанолом никогда нельзя убрать носиком полностью последнюю каплю жидкости со дна пробирки, а с буфером Силекса пробирка остается почти сухой - подозреваю, что эфир там именно для этого, поверхностное натяжение менять.
Но в составе ничего такого нет, обманывают?



T2006 23.09.2013 12:06
(genseq @ 11.09.2013 21:11)
Ссылка на исходное сообщение  
Буду признателен за любые предложения. Если предложения будут не теоретические, а практические (по их испытаниям), то берусь обеспечить и магносорбентами, и магнитными штативами:
http://molbiol.ru/forums/index.php?act=Att...=post&id=181131 ( http://molbiol.ru/forums/index.php?act=Att...=post&id=181131 )[/url]


Genseq, нас интересуют магносорбенты на пробу, беремся их проверить )))
Как с Вами связаться?



-Ъ- 23.09.2013 15:42
Генсек мне давал на испытание (то бишь сравнить с моими магносорбентом и нат. силикой), а мне все некогда frown.gif . Приходите, отолью, если, конечно, Генсек не возражает. smile.gif
Баба с возу - потехе час. rolleyes.gif



kblag 26.09.2013 08:05
Я бы тоже хотел попробовать.
Ещё есть возможность?



genseq 02.10.2013 08:37
Пузырёк, отправленный обычной посылкой в Новосибирск, застрял в Москве. Наверное, не понравился рентгеновскому аппарату. frown.gif
А вот отправленные одновременно с ним магнитные штативы на Казанском вокзале отметились 25 сентября и должны быть уже где-то на подходе к Новосибирску. beer.gif

Появилась идея магносорбенты рассылать в письмах - в пакетиках, содержащих по 1...2 г. сухого порошка, похожего на обычную глину. Интересно, письма рентгеном проверяют? confused.gif



genseq 10.10.2013 17:49
Первая проверка силикатных сорбентов прошла успешно. Превосходят магносорбенты Промеги и Силекса. jump.gif Не уступают ИзоГеновским. beer.gif



Guest 11.10.2013 08:24
(genseq @ 10.10.2013 17:49)
Ссылка на исходное сообщение  Первая проверка силикатных сорбентов прошла успешно. Превосходят магносорбенты Промеги и Силекса.  jump.gif Не уступают ИзоГеновским. beer.gif


ну и сколко ДНКа из 30 миклов кровушки ? smile.gif

http://www.lifetechnologies.com/us/en/home...-universal.html ( http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dynabeads-dna-direct-universal.html )



-Ъ- 15.10.2013 10:36
(genseq @ 10.10.2013 18:49)
Ссылка на исходное сообщение  Первая проверка силикатных сорбентов прошла успешно. Превосходят магносорбенты Промеги и Силекса.  jump.gif Не уступают ИзоГеновским. beer.gif

Как бы ознакомиться с протоколом испытаний? Ведь магносорбенты из одного кита могут не работать с растворами кита другого производителя. Я такое наблюдал когда сравнивал "все своё" с промеговским магносорбентом.



-Ъ- 15.10.2013 10:41
(Guest @ 11.10.2013 09:24)
Ссылка на исходное сообщение  ну и сколко ДНКа из 30 миклов кровушки ? smile.gif

http://www.lifetechnologies.com/us/en/home...-universal.html ( http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/dna-extraction-protocols/dynabeads-dna-direct-universal.html )

Потери - не более 20%, многое зависит от состояния "кровушки".
В этой ссылке не совсем аналог, того что делает Генсек.



genseq 15.10.2013 10:59
Вторые испытания с той же партией сорбентов провалились. Похоже, из-за зарастания какой-то микрофлорой. Сорбент норовил закупорить носик пипетки, да ещё и ингибировал ПЦР. Правда, в них участвовала ещё одна партия, приготовленная позднее. С ней всё прошло отлично.

Похоже, зря я в этот раз отмыл сорбенты фосфатным буфером. В сочетании со следами аммония буферный раствор оказался весьма питательным. И похоже, что не зря Силекс консервирует свои сорбенты азидом натрия. Теперь тоже буду всё консервировать.



Файл/ы:

Скачать файл 091013_xy__________1.pdf
Размер:: 371.38к
кол-во скачиваний: 348




genseq 15.10.2013 11:22
С протоколами Real-time дела не имел и даже не пытался в них вглядываться. Показалось всё очень запутанным, поэтому целиком доверился выводам испытателя (kblag). Кстати, это он разрешил выложить здесь протокол целиком, за что приношу ему свою искреннюю благодарность. beer.gif

Сейчас попытался вглядеться. Если ограничиться только рассмотрением результатов с bACT, то даже первая партия (0,8...0,9) выглядит вполне конкурентоспособно. Вторая там обозначена как 1,5...2,0. Кажется, выглядит тоже вполне достойно. Цифры в обозначении указывают на средний размер частиц магносорбента. rolleyes.gif



-Ъ- 15.10.2013 11:43
(genseq @ 15.10.2013 12:22)
Ссылка на исходное сообщение  С протоколами Real-time дела не имел и даже не пытался в них вглядываться. Показалось всё очень запутанным, поэтому целиком доверился выводам испытателя (kblag). Кстати, это он разрешил выложить здесь протокол целиком, за что приношу еме свою благодарность.

Сейчас попытался вглядеться. Если ограничиться только рассмотрением результатов с bACT, то даже первая партия (0,8...0,9) выглядит вполне конкурентоспособно. Вторая там обозначена как 1,5...2,0. Кажется, выглядит тоже вполне достойно. Цифры в обозначении указывают на средний размер частиц магносорбента.

Протокол явно "ДСП". smile.gif Чтобы разбираться, нужно знать "шриф-код" обозначений. Короче, без бутылки не разобраться. wink.gif



-Ъ- 15.10.2013 13:18
Реал-тайм это, конечно, хорошо, но в лаборатории должны быть еще и классические методы - необходимо смотреть в первую очередь как выглядит ДНК на агарозном форезе. Тем более что сорбенты имеют привычку рвать на кусочки высокомолекулярную ДНК, особенно если размер сорбента существенно меньше микрона.
Сомневаюсь что они успели так быстро зарасти в холодильнике. У тебя же есть Проклин, в нейтральных и кислых средах лучше не придумаешь. NaN3 тоже не помешает.



genseq 15.10.2013 15:57
В зарастании я и сам сильно сомневаюсь. Скорее всего, мелкие частички после отстаивания хуже суспендируются. На ощупь магносорбенты не отличаются от глины. Если хорошенько не протрясти на вортексе, то могут остаться комочки, забивающие носики. Если причина в этом, то их проверку нельзя считать неудачной. Точнее - их проверка показала, что не следует делать силикатные сорбенты слишком мелкими (< 1 мкм).

Что касается результатов с сорбентами 1,5...2 мкм, то мне они кажутся вполне достойными. Попытался обобщить данные протокола испытаний. Не уверен, что сделал это правильно, но получил такую табличку значений Cq Mean (среднее количество циклов) для своего сорбента (1,5...2) и сорбентов сравнения (126 и 320). Различия незначительны и находятся в пределах статистической достоверности:
40.44к -



genseq 16.10.2013 10:34
Кажется, проясняется механизм связывания ДНК/РНК с силикатами.
Нейтрально заряженные силанольные группы (Si-OH) образуют с отрицательно заряженными фосфатными группами (P-O) в кислой среде диэфирные связи (Si-0-P). Такие связи стабильны в кислой среде, но легко гиролизуются в щелочных условиях.

Интересно, что этот известный в неорганической химии факт почему-то никто не ассоциирует с механизмом сорбции ДНК/РНК силикатами. Или я это просто не нашёл?



-Ъ- 16.10.2013 11:12
(genseq @ 16.10.2013 11:34)
Ссылка на исходное сообщение  Кажется, проясняется механизм связывания ДНК/РНК с силикатами.
Нейтрально заряженные силанольные группы (Si-OH) образуют с отрицательно заряженными фосфатными группами (P-O) в кислой среде диэфирные связи (Si-0-P). Такие связи стабильны в кислой среде, но легко гиролизуются в щелочных условиях.

Интересно, что этот известный в неорганической химии факт почему-то никто не ассоциирует с механизмом сорбции ДНК/РНК силикатами. Или я это просто не нашёл?

На самом деле механизм сорбции другой, где кроме рН среды не менее важную роль играет ионная сила.
А какова роль 5 М хаотропных агентов? Причем не все хаотропы годятся для этого! Ты не нашел, все давно расписано. smile.gif



genseq 16.10.2013 18:53
(-Ъ- @ 16.10.2013 09:12)
Ссылка на исходное сообщение  На самом деле механизм сорбции другой, где кроме рН среды не менее важную роль играет ионная сила.
А какова роль 5 М хаотропных агентов? Причем не все хаотропы годятся для этого!  Ты не нашел, все давно расписано. smile.gif


Всё давно расписано:
1. Высокая ионная сила нейтрализует отталкивание ДНК/РНК отрицательно заряженной силикатной поверхностью.
2. Хаотропы к сорбции вообще отношения не имеют. Они лизируют вирусы и денатурируют белки, связанные с нуклеиновыми кислотами. Ещё они денатурируют ДНКазы и РНКазы.

Давно описаны методики выделения без хаотропов. Например:
Прикреплённое изображение



Файл/ы:

Скачать файл Germany_2005.pdf
Размер:: 141.22к
кол-во скачиваний: 277




T2006 17.10.2013 08:22
(-Ъ- @ 15.10.2013 11:36)
Ссылка на исходное сообщение  Как бы ознакомиться с протоколом испытаний? Ведь магносорбенты из одного кита могут не работать с растворами кита другого производителя. Я такое наблюдал когда сравнивал "все своё" с промеговским магносорбентом.


Просто заменили маг. сорбенты из кита Промеги на другие различные. И если со своими "родными" растворами промеговские частицы заметно хуже работали, чем магносорбенты от Генсека и из Изогена - это тоже ведь о чем-то говорит?
Проблема возникает с нормированием по концентрации и размеру частиц разного производства - одни растворы частиц более концентрированные, др. менее, одни частицы крупнее, др. мельче. Пока брали так, чтобы частиц для сорбции было заведомо достаточно.



-Ъ- 17.10.2013 11:24
(T2006 @ 17.10.2013 09:22)
Ссылка на исходное сообщение  Просто заменили маг. сорбенты из кита Промеги на другие различные. И если со своими "родными" растворами промеговские частицы заметно хуже работали, чем магносорбенты от Генсека и из Изогена - это тоже ведь о чем-то говорит?
Проблема возникает с нормированием по концентрации и размеру частиц разного производства - одни растворы частиц более концентрированные, др. менее, одни частицы крупнее, др. мельче. Пока брали так, чтобы  частиц для сорбции было заведомо достаточно.

Спасибо, очень ценная инфа. Я тоже сравнивал в свое время все доступные магносорбенты на своем ките, со своими растворами, доведенными "до ума" на нативной силике. При всем уважении к Промеге, их сорбент рвал ДНК на мелкие куски (ДНК фага Лямбда превращалась в шмерок) и выход был меньше 30%.

Очень мелкий сорбент , меньше микрона, оптимально использовать при выделении ДНК/РНК из плазмы, сыворотки или др., а более крупный, 2-10 мкм, - из образцов с избытком материала (кровь, гомогенаты тканей и т.п.).
Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и варьировать его количество в зависимости от природы иссл. образца (количества ДНК в образце).
Если возникнут вопросы при испытании - обращайтесь, можно в личку.



-Ъ- 17.10.2013 12:07
(genseq @ 16.10.2013 19:53)
Ссылка на исходное сообщение  Всё давно расписано:
1. Высокая ионная сила нейтрализует отталкивание ДНК/РНК отрицательно заряженной силикатной поверхностью.
2. Хаотропы к сорбции вообще отношения не имеют. Они лизируют вирусы и денатурируют белки, связанные с нуклеиновыми кислотами. Ещё они денатурируют ДНКазы и РНКазы.

Давно описаны методики выделения без хаотропов. Например:
Прикреплённое изображение

Генсек, мы с тобой сравниванием "мягкое" с "теплым" - посмотри какой
в статье рН - 4!!!! А я всегда работаю в нейтральной среде. Поэтому можешь дальше теоретизировать, но без меня. wink.gif - механизмы отличаются как земля и небо.
Кстати, статья так себе хоть и новая. Нет доверия авторам использующим Трис-ацетат буфер с рН = 4. Трис - буферы с рН меньше 7 это не буферы. tongue.gif

Еще добавлю - элюция ДНК с сорбента 10 мин при 80 оС - это "финиш", а использование Протеиназы К в современных китах для автоматизации процесса - тоже шаг не вперед. Так что думай, Чапай... smile.gif



arndt 17.10.2013 12:28
(-Ъ- @ 17.10.2013 12:24)
Ссылка на исходное сообщение  Спасибо, очень ценная инфа. Я тоже сравнивал в свое время все доступные магносорбенты на своем ките, со своими растворами, доведенными "до ума" на нативной силике. При всем уважении к Промеге, их сорбент рвал ДНК на мелкие куски (ДНК фага Лямбда превращалась в шмерок) и выход был меньше 30%.

Очень мелкий сорбент , меньше микрона, оптимально использовать при выделении ДНК/РНК из плазмы, сыворотки или др., а более крупный, 2-10 мкм, - из образцов с избытком материала (кровь, гомогенаты тканей и т.п.).
Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и варьировать его количество в зависимости от природы иссл. образца (количества ДНК в образце).
Если возникнут вопросы при испытании - обращайтесь, можно в личку.


Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и smile.gif

ПротеинА/Г магнитные шарики для ИП smile.gif

можно в такие вляпатся smile.gif



-Ъ- 17.10.2013 12:47
(arndt @ 17.10.2013 13:28)
Ссылка на исходное сообщение  Но лучше всего держать под рукой ОДИН сорбент на все случаи жизни и  smile.gif

ПротеинА/Г магнитные шарики для ИП smile.gif

можно в такие вляпатся smile.gif

Мне должно наверное присниться что это такое А/Г и ИП. confused.gif
Ты же любишь на каждый звук ссылку кидать! confused.gif Неисправим чел. no.gif



comp3v 17.10.2013 12:51
это всего лишь Protein A/Protein G - для иммунопреципитации



arndt 17.10.2013 12:51
(-Ъ- @ 17.10.2013 13:47)
Ссылка на исходное сообщение  Мне должно наверное присниться что это такое А/Г и ИП. confused.gif
Ты же любишь на каждый звук ссылку кидать! confused.gif  Неисправим чел. no.gif

http://www.lifetechnologies.com/de/de/home...cipitation.html ( http://www.lifetechnologies.com/de/de/home/life-science/protein-expression-and-analysis/protein-sample-preparation-and-protein-purification/proteinspproteiniso-misc/protein-isolation/ig-purification-and-immunoprecipitation.html )



-Ъ- 17.10.2013 13:40
Пока в этой теме речь не идет о SPRI-магношариках с -СООН группой. Ты вечно витаешь в облаках - мы пока говорим о сорбенте с Si-OH и выделении тотальной ДНК или РНК.
И причем тут это? http://www.lifetechnologies.com/de/de/home...cipitation.html ( http://www.lifetechnologies.com/de/de/home/life-science/protein-expression-and-analysis/protein-sample-preparation-and-protein-purification/proteinspproteiniso-misc/protein-isolation/ig-purification-and-immunoprecipitation.html )
Мало ли на свете магносорбентов. confused.gif



arndt 17.10.2013 15:17
(-Ъ- @ 17.10.2013 14:40)
Ссылка на исходное сообщение  Пока в этой теме речь не идет о СПРИ-магношариках с -СООН группой. Ты вечно витаешь в облаках - мы пока говорим о сорбенте с Си-ОХ и выделении тотальной ДНК или РНК.
И причем тут это? хттп://щщщ.лифетечнологиес.цом/де/де/хоме...ципитатион.хтмл ( http://www.lifetechnologies.com/de/de/home/life-science/protein-expression-and-analysis/protein-sample-preparation-and-protein-purification/proteinspproteiniso-misc/protein-isolation/ig-purification-and-immunoprecipitation.html )
Мало ли на свете магносорбентов. confused.gif


сколко можно о стекляшках говорить smile.gif



genseq 17.10.2013 15:32
(-Ъ- @ 17.10.2013 10:07)
Ссылка на исходное сообщение  Генсек, мы с тобой сравниванием "мягкое" с "теплым" - посмотри какой
в статье рН - 4!!!! А я всегда работаю в нейтральной среде. Поэтому можешь дальше теоретизировать, но без меня. wink.gif - механизмы отличаются как земля и небо.
Кстати, статья так себе хоть и новая. Нет доверия авторам использующим Трис-ацетат буфер с рН = 4. Трис - буферы с рН меньше 7 это не буферы. tongue.gif

Еще добавлю - элюция ДНК с сорбента 10 мин при 80 оС - это "финиш", а использование Протеиназы К в современных китах для автоматизации процесса - тоже шаг не вперед. Так что думай, Чапай... smile.gif


Статья старенькая (2005 г.). Огрехов в ней много, но и изюминка имеется. Даже две. Первая - отсутствие хаотропов, причём не случайное, а вполне обоснованное. Вторая - низкий pH (4,0), что обеспечивает ингибирование РНКаз не хуже хаотропов. umnik.gif

Понятно, что Tris нужно заменить ацетатом, а дорогую протеиназу К дешёвыми аптечными таблетками ацидин-пепсина. shuffle.gif

В нейтральной среде (pH 7,0) сорбировать можно, но есть риск нарваться на плохое связывание при небольшом защелачивании: rolleyes.gif
Прикреплённое изображение

Так что думай, Чапай ... smile.gif



-Ъ- 17.10.2013 16:46
Ингибировать Нуклеазы, особенно РНК-азы, при рН 4, в присутствии сульфата аммония такой низкой конц.ции еще никому не удавалось. В RNA Later (это подкисленный сульфат аммония с высокой концентрацией, 60-ые годы) РНК-азы действительно инактивируются, но обратимо, т.е не денатурируют. Только Протеназа К или хаотропы.
А использование его, RNA Later, напрямую как связывающую ДНК с силикафильтром среду не увенчалось успехом.
Про аптечные реактивы вообще не серьезно говорить - неуважение к себе, пардон. В свое время, собрав кучу сериновых протеаз, пытался изобразить замену протеиназе К - фиг вам - лучше протеиназы К против нуклеаз нет НИЧЕГО. Но как она будет работать в кислой среде - это еще бАльшой вопрос.
Кстати, у меня кривая получается ровно наоборот. tongue.gif
Я при выделении ДНК полностью избавляюсь от гемоглобина и гепарина. И еще, в том же связывающем растворе очень легко солюбилизируется агароза, свернувшаяся кровь и мягкие ткани. Так что, дерзай, если не хочешь прислушаться к 20-летнему опыту совершенствования одного метода. smile.gif
Многие беды от избытка знаний. umnik.gif
Я недавно говорил - надо уметь фильтровать инфу из литературы. cool.gif



-Ъ- 17.10.2013 16:54
(arndt @ 17.10.2013 16:17)
Ссылка на исходное сообщение  сколко можно о стекляшках говорить smile.gif

Ну займи себя чем-нибудь confused.gif



arndt 17.10.2013 17:13
(-Ъ- @ 17.10.2013 17:54)
Ссылка на исходное сообщение  Ну займи себя чем-нибудь confused.gif


магношарики имеют смысл когда робот - у меня генмол в основном простаивает -
пару раз включали smile.gif

а так - колонки Зимо или Квакаген smile.gif

http://www.biotechniques.com/multimedia/ar...tion_44229a.pdf ( http://www.biotechniques.com/multimedia/archive/00044/Automated_Extraction_44229a.pdf )



-Ъ- 17.10.2013 17:33
(arndt @ 17.10.2013 18:13)
Ссылка на исходное сообщение  магношарики имеют смысл когда робот - у меня генмол в основном простаивает -
пару раз включали smile.gif

а так - колонки Зимо или Квакаген smile.gif

http://www.biotechniques.com/multimedia/ar...tion_44229a.pdf ( http://www.biotechniques.com/multimedia/archive/00044/Automated_Extraction_44229a.pdf )

(arndt @ 15.10.2013 17:56)
Ссылка на исходное сообщение  
на магносорбентах китах нет чистой ДНК - иногда на ТакМанах при 100 - 50 нанограмм нифига нет - потом разводиш до 1 нанограмм - все OK
у тебя термин "ингибировал" достаточно старомодный в реал-тайм ПЦР - если я развожу матрицу в 10 раз а у меня цикл скачет с 38 на 28 eek.gif
кабутто на твоих менше постав 10-кратные разведения против плазмиды и покажи народу

Заметьте, не я это предложил ©. no.gif (Покровские Ворота)



avial 17.10.2013 23:33
http://www.nexttec.biz/ ( http://www.nexttec.biz/ )



arndt 18.10.2013 10:31
(avial @ 18.10.2013 00:33)
Ссылка на исходное сообщение  хттп://щщщ.нехттец.биз/ ( http://www.nexttec.biz/ )


100 рублей на пробу smile.gif

http://www.biozym.com/desktopmodules/websh...aus%20Bakterien ( http://www.biozym.com/desktopmodules/webshop/shopdisplayproducts.aspx?id=1717&cat=Genomische%20DNA%20aus%20Bakterien )



arndt 18.10.2013 12:00
(avial @ 18.10.2013 12:24)
Ссылка на исходное сообщение  Ну кто не хочет обращаться к разработчикам - тратит по 100 рублей на пробу. А вообще этот сорбент родом из ИБХ.


я уже заказал пробнички этих "чудо-колонок" - посмотрим на цена-качество smile.gif



-Ъ- 18.10.2013 15:54
Принцип метода тот же - сорбция на силике и последующие отмывки, но с использованием МАНИФОЛДа с вакуумом. Тот же микроколоночный метод с силикафильтрами и ничего нового. Если это не так и сорбент это особенный и родом и ИБХ - дайте ссылку, посмотрим что за новинка. Но я уверен, что это манифолдный вариант в комплекте с многоканальной (8) пипеткой - самый оптимальный для масштабирования пробоподготовки и не нужно покупать роботизированные станции. Дороговизна из-за манифолда с готовым сорбентом. Вот все. smile.gif
Это мы уже обсуждалы на этом форуме...



-Ъ- 18.10.2013 15:57
(arndt @ 18.10.2013 13:00)
Ссылка на исходное сообщение  я уже заказал пробнички этих "чудо-колонок" - посмотрим на цена-качество smile.gif

Хлебом не корми, дай человеку поиграться. smile.gif
Мы все, во главе с Генсеком, будем рады результатам твоих испытаний! yes.gif



genseq 18.10.2013 15:58
http://www.ibch.ru/structure/groups/synthpolym/127 ( http://www.ibch.ru/structure/groups/synthpolym/127 )

2011–2013 Контракт № 1 от 01.02.2009 г. между ИБХ РАН и ООО "Амбер" (г. Санкт-Петербург) в рамках выполненияГосударственного контракта № 9411.1003702.13.031 ("Разработка и оптимизация высокоэффективной комплексной системы одноэтапного выделения, очистки и концентрирования нуклеиновых кислот для ПЦР-анализа с целью выявления и идентификации микроорганизмов и ДНК-маркеров», шифр "Биопроба") - Ответственный исполнитель. Синтез сорбентов, разработка биосепарирующих элеиентов. Ведение технической и финансовой документации.



arndt 18.10.2013 16:16
(-Ъ- @ 18.10.2013 16:57)
Ссылка на исходное сообщение  Хлебом не корми, дай человеку поиграться. smile.gif
Мы все, во главе с Генсеком, будем рады результатам твоих испытаний! yes.gif


с чем сравнить - могу с ЗимоКвик smile.gif

http://www.zymoresearch.com/dna-purificati...-gdna-microprep ( http://www.zymoresearch.com/dna-purification/genomic-dna/cell-soft-tissue-dna/quick-gdna-microprep )



-Ъ- 18.10.2013 16:45
(genseq @ 18.10.2013 16:58)
Ссылка на исходное сообщение  http://www.ibch.ru/structure/groups/synthpolym/127 ( http://www.ibch.ru/structure/groups/synthpolym/127 )

2011–2013  Контракт № 1 от 01.02.2009 г. между ИБХ РАН и ООО "Амбер" (г. Санкт-Петербург) в рамках выполненияГосударственного контракта № 9411.1003702.13.031 ("Разработка и оптимизация высокоэффективной комплексной системы одноэтапного выделения, очистки и концентрирования нуклеиновых кислот для ПЦР-анализа с целью выявления и идентификации микроорганизмов и ДНК-маркеров», шифр "Биопроба") - Ответственный исполнитель. Синтез сорбентов, разработка биосепарирующих элеиентов. Ведение технической и финансовой документации.

Силика, покрытая полианилином, пористая (70А)... нет, не знаком с такой фишкой.
Да и мало ли модифицированных силикагелей используется для узкоспецифического применения. confused.gif в хроматографии.



arndt 18.10.2013 16:54
(-Ъ- @ 18.10.2013 17:45)
Ссылка на исходное сообщение  Силика, покрытая полианилином, пористая (70А)... нет, не знаком с такой фишкой.
Да и мало ли модифицированных силикагелей используется для узкоспецифического применения. confused.gif в хроматографии.

http://www.google.de/patents/US7772152 ( http://www.google.de/patents/US7772152 )



arndt 18.10.2013 17:04
самый крутой тест на ингибиторы - выделить ДНК из чернозема smile.gif



-Ъ- 18.10.2013 17:19
(arndt @ 18.10.2013 17:16)
Ссылка на исходное сообщение  с чем сравнить - могу с ЗимоКвик smile.gif

http://www.zymoresearch.com/dna-purificati...-gdna-microprep ( http://www.zymoresearch.com/dna-purification/genomic-dna/cell-soft-tissue-dna/quick-gdna-microprep )

Вот нашел, надеюсь, речь об этом методе:
http://www.rjbc.ru/arc/29/3/0310-0315.pdf ( http://www.rjbc.ru/arc/29/3/0310-0315.pdf )



-Ъ- 18.10.2013 17:48
(arndt @ 18.10.2013 18:04)
Ссылка на исходное сообщение  самый крутой тест на ингибиторы - выделить ДНК из чернозема smile.gif

Иишо круче - асфальт с черноземом в смеси с кровью eek.gif

Недастатки (основные и навсидку) метода выд. ДНК с сорбентом, покрытым полианилином:
1. Лизис клеток придется проводить с использованием традиционных растворов с детергентами и Протеиназой К и, в связи с этим, еще больше разбавляешь исходный анализируемый образец.
2. ВсЁ задерживается на сорбенте, в том числе низкомолекулярные компоненты, детергенты и Протеиназа К (в чем очень сомневаюсь), а чистая ДНК, но уже сильно разбавленная пролетает сорбент и собирается в пробирке-приемнике. А если ДНК мало в образце, придется концентрировать. Но как ???? Методов конц-рования конечно много, но confused.gif Меня волнует следы Протеиназы К, но больше всего - возможные и вечно сопутствующие выделению ДНК полисахариды, типа гепарина и т.д



avial 18.10.2013 17:51
Да, да, угадали правильно - именно Капустин.



-Ъ- 18.10.2013 18:16
Сижу и думаю - это ведь действительно классный сорбент, но для другого формата выделения. На основе его можно предлагать экспресс методы типа кипячения Chelex 100 - Добавил к образцу или суспензии клеток, встряхнул, термостатировал, ЦФ и на анализ. Идеально для плазмы и сываротки для массового скрининга. cool.gif



Guest 19.10.2013 02:31
а для выделения РНК ваши сорбенты сможете приспособить?



kloun 19.10.2013 06:29
Про РНКу для сиквенса.
Мне бы пригодились колонки или 96-чашки, как у Zymo, но чтобы связывали всего 500нг - 1 мкг РНКи и можно было сконцентрировать в 3-5мкл воды всего - такая типа мини-плашки для РНКи.
Тогда ОД не нужно было бы мерить)



arndt 20.10.2013 10:43
(kloun @ 19.10.2013 07:29)
Ссылка на исходное сообщение  Про РНКу для сиквенса.
Мне бы пригодились колонки или 96-чашки, как у Зымо, но чтобы связывали всего 500нг - 1 мкг РНКи и можно было сконцентрировать в 3-5мкл воды всего - такая типа мини-плашки для РНКи.
Тогда ОД не нужно было бы мерить)


вроде ест ПЦРные 96 плашки покрытые стеклом там связывание неболшое но одинаковое хотя можно шарики с адаптерами



arndt 20.10.2013 10:47
(kloun @ 19.10.2013 07:29)
Ссылка на исходное сообщение  Про РНКу для сиквенса.
Мне бы пригодились колонки или 96-чашки, как у Зымо, но чтобы связывали всего 500нг - 1 мкг РНКи и можно было сконцентрировать в 3-5мкл воды всего - такая типа мини-плашки для РНКи.
Тогда ОД не нужно было бы мерить)


надоело нормализоват мултиплекс библиотеки для Иллумины ? smile.gif



arndt 20.10.2013 11:17
(kloun @ 19.10.2013 07:29)
Ссылка на исходное сообщение  Про РНКу для сиквенса.
Мне бы пригодились колонки или 96-чашки, как у Zymo, но чтобы связывали всего 500нг - 1 мкг РНКи и можно было сконцентрировать в 3-5мкл воды всего - такая типа мини-плашки для РНКи.
Тогда ОД не нужно было бы мерить)

http://supportres.illumina.com/documents/d..._15044364_a.pdf ( http://supportres.illumina.com/documents/documentation/chemistry_documentation/dx/miseqdx_cystic_fibrosis_diagnostic_assay/miseqdx_cf_diagnostic_assay_ltf_15044364_a.pdf )



kloun 21.10.2013 09:48
(arndt @ 20.10.2013 10:47)
Ссылка на исходное сообщение  надоело нормализоват мултиплекс библиотеки для Иллумины ? smile.gif

Не совсем - мы можем сделать сотни и тысячи библиотек для РНК-сика даже руками за 2 дня - стоит несколько баксов на лунку - но нужно вносить образцы с малой разницей по массе - ну или мерить массу - что геморно.
А вот если пронормализовать все РНКи даже с потерей по массе - то можно тысячи в день варить.



arndt 21.10.2013 11:10
(kloun @ 21.10.2013 10:48)
Ссылка на исходное сообщение  Не совсем - мы можем сделать сотни и тысячи библиотек для РНК-сика даже руками за 2 дня - стоит несколько баксов на лунку - но нужно вносить образцы с малой разницей по массе - ну или мерить массу - что геморно.
А вот если пронормализовать все РНКи даже с потерей по массе - то можно тысячи в день варить.


этож сколько нужно Хисеков 2000 на 1000 РНКаСеков confused.gif eek.gif



arndt 21.10.2013 14:16
(kloun @ 21.10.2013 10:48)
Ссылка на исходное сообщение  Не совсем - мы можем сделать сотни и тысячи библиотек для РНК-сика даже руками за 2 дня - стоит несколько баксов на лунку - но нужно вносить образцы с малой разницей по массе - ну или мерить массу - что геморно.
А вот если пронормализовать все РНКи даже с потерей по массе - то можно тысячи в день варить.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/P...one.0066883.pdf ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3691247/pdf/pone.0066883.pdf )



kloun 22.10.2013 07:41
(arndt @ 21.10.2013 11:10)
Ссылка на исходное сообщение  этож сколько нужно Хисеков 2000 на 1000 РНКаСеков  confused.gif  eek.gif

Просто много разных сиквенсов РНКа существует. Тот же бактериальный, да есть и пара других методов у человека, которые уже посланы, но пока не вышли в печать - там достаточно 2-10М пар - что при выхлопе ХайСика в 2-3 ярда позволит сделать от 100 до 1000 образцов зараз. Сейчас сделать 1 библиотеку стоит в фасилити около 400 баксов - то есть, только сделать 1000 библиотек займёт почти пол-ляма грина - очень дорого.



-Ъ- 22.10.2013 10:12
(Guest @ 19.10.2013 03:31)
Ссылка на исходное сообщение  а для выделения РНК ваши сорбенты сможете приспособить?

Вопрос ко мне или Генсеку?

В том формате выделения, в каком используются магнитные шарики - сорбция в объеме - вряд ли, только суммарные НК. На микроколоночках - другое дело, но это уже из другой оперы.



arndt 22.10.2013 10:51
(-Ъ- @ 22.10.2013 11:02)
Ссылка на исходное сообщение  Ты от Генсека клизму заработал за офтоп.


почему оффтоп - генсек же главный пропагандист полупроводниковых РНК-сек smile.gif

http://bgiamericas.com/ion-proton-rna-seq-service/ ( http://bgiamericas.com/ion-proton-rna-seq-service/ )



-Ъ- 23.10.2013 15:35
(arndt @ 22.10.2013 11:51)
Ссылка на исходное сообщение  почему оффтоп - генсек же главный пропагандист полупроводниковых РНК-сек smile.gif

http://bgiamericas.com/ion-proton-rna-seq-service/ ( http://bgiamericas.com/ion-proton-rna-seq-service/ )

Но песня все равно не о нем - Генсек сейчас делает магносорбент, может быть даже лучший и дешевый в мире! smile.gif



srcamb 23.10.2013 21:34
А есть возможность подключится к этим вашим испытаниям? Я, правда, занимаюсь иммунопреципитацией, антитела свои, частицы импортные (причем будут нано и микронные, в сравнении). Вот если бы ещё и частицы были отечественные. Так скажем укрепление обороноспособности smile.gif



genseq 23.10.2013 21:37
(srcamb @ 23.10.2013 19:34)
Ссылка на исходное сообщение  А есть возможность подключится к этим вашим испытаниям? Я, правда, занимаюсь иммунопреципитацией, антитела свои, частицы импортные (причем будут нано и микронные, в сравнении). Вот если бы ещё и частицы были отечественные. Так скажем укрепление обороноспособности smile.gif


Пишите на E-mail. Адрес здесь:
http://www.genseq.ru/racks.html ( http://www.genseq.ru/racks.html )



arndt 23.10.2013 22:00
(genseq @ 23.10.2013 22:37)
Ссылка на исходное сообщение  Пишите на Е-маил. Адрес здесь:
хттп://щщщ.генсея.ру/рацкс.хтмл ( http://www.genseq.ru/racks.html )

генсек нехорошо заманиват молоденких девушек smile.gif



srcamb 23.10.2013 22:10
Увы и ах, не молоденькая и не девушка smile.gif У меня хемиселлы четырех видов, обещают вот-вот флюидмаг. Сейчас я пока гибридому разгоняю, маловато АТ даёт и асцитогенность не очень. А вообще, это больше джаст фо фан smile.gif у меня магистрская.
зы Про обороноспособность я пошутил, если что smile.gif



genseq 24.10.2013 08:27
(genseq @ 23.10.2013 19:37)
Ссылка на исходное сообщение  Пишите на E-mail. Адрес здесь:
http://www.genseq.ru/racks.html ( http://www.genseq.ru/racks.html )


Насколько я понял, Вам желательно иметь магносорбенты с белками A или G. Ещё лучше - с теми же белками, но для повышения сорбционной ёмкости иммобилизоваными на агарозной оболочке магнетитных микросфер. Или ещё проще - смесь клеток стафилококка с частицами магнетита, заключенными в агарозные гранулы.

В 80-е кто-то производил препараты формализированных стафилококковых клеток, предназначенных для иммуносорбции (лиофильно высушенные, в больших ампулах). По нынешним временам это, наверное, не катит.

Может быть, кто-нибудь имеет продуценты A/G белков (или сами белки в неограниченных количествах)?



srcamb 24.10.2013 08:57
Не обязательно с белками а/г, но, по всей видимости, проще будет с ними работать. Ещё раз оговорюсь, задача у меня учебная, и какие-то глобальные исследования проводить просто нет времени. А хотел я сравнить, что вот микронные частицы с такой эффективностью извлекаю, нано с такой. Объект — листерии. Нужно выделить из большого объёма, молока допустим, и потом либо на пцр, либо на чашки. То есть ещё показать насколько вредны нано для последующего культивирования. Самому попробовать делать делать частицы интересно, но время…



genseq 24.10.2013 12:38
Пока я ориентируюсь исключительно на ДНК. С иммунологами знакомства имею, так что если они проявят интерес, то сделаю и для них. Если у Вас интерес не пропадёт, то напишите через пару месяцев. Может быт,ь к тому времени появится что-нибудь и для иммуносорбции.



srcamb 24.10.2013 18:00
Ок, интерес не пропадет.



E-Student 25.11.2013 18:40
Здравствуйте!
Прошу совета у опытных людей.
У меня диплом по магнитным частицам. Я синтезирую магнетит, а потом покрываю его силикагелем путем гидролиза ТЭОС в сильно щелочной среде. На полученные частицы я пытаюсь адсорбировать ДНК лосося и РНК дрожжей из раствора. Условия адсорбции - 5М раствор гуанидина тиоцианата и слабокислый рН (взято из литературы).
Так вот ДНК адсорбируется отлично, а РНК совсем нет. Если кто-либо сталкивался в своей работе с подобной проблемой, подскажите в какую сторону копать. Буду очень признателен за любую помощь smile.gif



avial 25.11.2013 18:49
А может РНК просто валится быстро?



distemper 26.11.2013 03:12
(E-Student @ 25.11.2013 16:40)
Ссылка на исходное сообщение  Здравствуйте!
Прошу совета у опытных людей.
У меня диплом по магнитным частицам. Я синтезирую магнетит, а потом покрываю его силикагелем путем гидролиза ТЭОС в сильно щелочной среде. На полученные частицы я пытаюсь адсорбировать ДНК лосося и РНК дрожжей из раствора. Условия адсорбции - 5М раствор гуанидина тиоцианата и слабокислый рН (взято из литературы). 
  Так вот ДНК адсорбируется отлично, а РНК совсем нет. Если кто-либо сталкивался в своей работе с подобной проблемой, подскажите в какую сторону копать. Буду очень признателен за любую помощь smile.gif

а вы сорбируйте РНКу в 2М гуанидине:50% этанол, сядет как миленькаяsmile.gif



genseq 26.11.2013 07:07
Подозреваю, что дело не в посадке РНК, а в её плохой десорбции. shuffle.gif

В кислой среде идёт химическая реакция образования связей P-O-Si, которые при защелачивании гидролизуются. Двунитевая ДНК из-за жёсткой вторичной структуры связывается силикатной поверхностью в отдельных точках, а РНК отличается повышенной гибкостью, связывается гораздо прочнее и смывается (гидролизуются все связи) медленнее. umnik.gif

Если это правда, то смывать РНК нужно не спеша. Дайте сорбенту с ней постоять часок-другой в слабощелочном буфере (pH~9). Вы будете смеяться, но, судя по всему, ионная сила при смывании ДНК/РНК значения не имеет. tongue.gif



E-Student 27.11.2013 19:35
(distemper @ 26.11.2013 07:12)
Ссылка на исходное сообщение  а вы сорбируйте РНКу в 2М гуанидине:50% этанол, сядет как миленькаяsmile.gif

Спасибо, попробую!

(genseq @ 26.11.2013 11:07)
Ссылка на исходное сообщение  Подозреваю, что дело не в посадке РНК, а в её десорбции. shuffle.gif 

В кислой среде идёт химическая реакция образования связей P-O-Si, которые при защелачивании гидролизуются. Двунитевая ДНК из-за жёсткой вторичной структуры связывается силикатной поверхностью в отдельных точках, а РНК отличается повышенной гибкостью, связывается гораздо прочнее и смывается (гидролизуются все связи) медленнее.  umnik.gif

Если это правда, то смывать РНК нужно не спеша. Дайте сорбенту с ней постоять часок-другой в слабощелочном буфере (pH~9). Вы будете смеяться, но, судя по всему, ионная сила при смывании ДНК/РНК значения не имеет.  tongue.gif


Дело именно в адсорбции. Измеряю оптическую плотность раствора ДНК или РНК, затем инкубирую его с частицами, потом опять измеряю оптическую плотность. В случае ДНК она уменьшается, а в случае РНК - нет.



ASDF 27.11.2013 21:02
А есть разница в сорбции двухцепочечной или одноцепочечной ДНК на силику?



VZ 03.01.2014 18:32
(ASDF @ 27.11.2013 21:02)
Ссылка на исходное сообщение  А есть разница в сорбции двухцепочечной или одноцепочечной ДНК на силику?


Похоже, особой разницы нет. rolleyes.gif



Guest 10.01.2014 03:03
разница есть, даже патент есть на эту тему, сцылку искать лень



genseq 11.02.2014 09:46
Суспензии силикатных магносорбентов при длительном хранении нестабильны. Частицы норовят слипнуться. Высушил пол грамма. Через пол года суспендировал. Хорошо сохранились! Суспендируются отлично. Фракционный состав не изменился.

Похоже, нужно переходить на сухие препараты.



Guest 11.06.2014 07:40
И когда будут сухие препараты?



genseq 04.07.2014 08:41
Для сухих препаратов нужна лиофильная сушка и большие количества сорбентов rolleyes.gif .

На днях обнаружил по соседству сушилку. Надеюсь, с её хозяевами удастся договориться beer.gif . Приготовил несколько стограммовых препаратов. Постараюсь сегодня оценить их фракционный состав и засушить smile.gif .



genseq 31.07.2014 08:32
Вчера высушил на лиофильной сушке 15 грамм. jump.gif
Исходная партия оседала очень медленно и легко ресуспендировалась. Сухие почему-то ресуспендироваться в воде не желают. Быстро оседают на дно. weep.gif
Похоже, придётся или искать распылительную сушилку, или не выпендриваться и делать как все - поставлять в виде суспензии. confused.gif



-Ъ- 01.08.2014 13:23
(genseq @ 31.07.2014 09:32)
Ссылка на исходное сообщение  Вчера высушил на лиофильной сушке 15 грамм.  jump.gif
Исходная партия оседала очень медленно и легко ресуспендировалась. Сухие почему-то ресуспендироваться в воде не желают. Быстро оседают на дно.  weep.gif
Похоже, придётся или искать распылительную сушилку, или не выпендриваться и делать как все - поставлять в виде суспензии.  confused.gif

Правильно, не выпендривайся smile.gif .
Замени среду Ц/Ф-нием пару раз, добавь забуференную среду с консервантами и на 4 оС. Главнее - нанести плотный надежный слой силики.
И привези на испытания.



genseq 01.08.2014 16:58
(-Ъ- @ 01.08.2014 11:23)
Ссылка на исходное сообщение  Правильно, не выпендривайся smile.gif .
Замени среду Ц/Ф-нием пару раз, добавь забуференную среду с консервантами и на 4 оС. Главнее - нанести плотный надежный слой силики.
И привези на испытания.


Ценрифугированием - это слишком сложно. Проще примагнитить. Среду забуферивать тоже не нужно. Потом придётся разбуферивать. Слои за отчётный период наловчился наносить любой толщины. Но для их уплотнения нужно время. Так что поставил пол кило частиц на созревание и уехал отдыхать. Через пару недель вернусь и с ближайшей оказией передам или сам привезу на испытания.



genseq 30.09.2014 18:47
Летние испытания показали, что мелкие частицы (0,6 мкм) после сорбции ДНК слишком сильно слипаются и плохо ресуспендируются wall.gif . Пришлось увеличить средний размер частиц до 3 мкм. smile.gif
Проверку эта партия прошла успешно. beer.gif Осталось её (0,6 л) разлить по пузырькам (по 20 мл, т.е. ~30 шт.). shuffle.gif Главная проблема - соорудить приличные этикетки типа:



Картинки:
Прикреплённое изображение

-Ъ- 01.10.2014 11:06
Главное - придумать короткое и уникальное название.
Я так и не забрал образец на испытание у соседей.



genseq 15.10.2014 18:27
Продолжается отработка технологии приготовления магнитного силикагеля. При использовании в качестве реакторов полуторалитровых бутылей получается примерно 50 г (сухой вес). Это достаточно для приготовления 1 литра суспензии со стандартной концентрацией 5% (или 5 литров с концентрацией 1%).

Пора переходить на реакторы объёмом 5...10 л. wink.gif



ASDF 16.10.2014 10:03
полуторалитровые бутыли, надеюсь, из-под пива ? tongue.gif



ASDF 21.10.2014 09:29
genseq посоветуйте буфер для связывания одноцепочечных коротких последовательностей (после реакции сиквенса) на колонке с силикой. У меня Binding buffer кончился вот от этого :
http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-...ng-clean-up-kit ( http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zr-dna-sequencing-clean-up-kit )
А колонок много, и их регенирировать можно.



genseq 21.10.2014 09:58
(ASDF @ 21.10.2014 07:29)
Ссылка на исходное сообщение  genseq посоветуйте буфер для связывания одноцепочечных коротких последовательностей (после реакции сиквенса) на колонке с силикой. У меня Binding buffer кончился вот от этого :
http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-...ng-clean-up-kit ( http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zr-dna-sequencing-clean-up-kit )
А колонок много, и их регенирировать можно.


На практике не проверял, но теоретические основы таковы:
1. pH<7 (сильно закислять нет смысла).
2. Обязательно "посолить" (например, NaCl >0,3 M).
3. ЭДТА

Низкая pH снижает отрицательный заряд силики и концентрацию гидроксилов в растворе.
Соль предотвращает отталкивание ДНК отрицательно заряженной силикой. Достаточно 0,2 М, но для полной гарантии добавляют до 0,4 М.
ЭДТА - чтобы убрать магний. Связыванию ДНК он не мешает, но может затруднить десорбцию.

Так что можно попробовать (теоретически) NaAc 0,3 М + 1 mM ЭДТА pH 6,0.



ASDF 21.10.2014 14:26
Спасибо.
Вы свои сорбенты не собираетесь для этого приспособить? Дело то хорошее и аналогов на рынке мало.



genseq 21.10.2014 16:32
Мне кажется, что в России у таких наборов нет коммерческой перспективы. Секвенированием занимаются исключительно бюджетные организации, которым проще закупать дорогие и проверенные наборы за бугром, чем связываться с дешёвыми наборами неизвестных отечественных поставщиков.

Если захотите поэкспериментировать со своими препаратами, то сорбентами обеспечу бесплатно и в любых количествах.



ASDF 21.10.2014 18:34
эти наборы для бигДай ремув неоправдано дорогие. Большинство или откручивает или с гель-фильтрацией мучается. Это как раз ниша вообще не занятая, в отличии от ДНК/РНК изоляции или ПЦР клиан-ап.

Только экспериментировать никому не хочется, мне то точно. Нужен набор готовый с буферами. А если его будет легко купить, например в хеликоне, то ....
я бы с удовольствием покупал. Многие, я уверен тоже.



genseq 23.10.2014 19:36
Теоретически всё не сложно, но экспериментировать не с чем. Можно повозиться с сорбцией-десорбцией флуоресцентно меченых праймеров, но без БигДаев убедиться в их качественном ремуве не удастся.



ASDF 25.10.2014 12:57
(genseq @ 21.10.2014 10:58)
Ссылка на исходное сообщение  На практике не проверял, но теоретические основы таковы:
1. pH<7 (сильно закислять нет смысла).
2. Обязательно "посолить" (например, NaCl >0,3 M).
3. ЭДТА

Низкая pH снижает отрицательный заряд силики и концентрацию гидроксилов в растворе.
Соль предотвращает отталкивание ДНК отрицательно заряженной силикой. Достаточно 0,2 М, но для полной гарантии добавляют до 0,4 М.
ЭДТА - чтобы убрать магний. Связыванию ДНК он не мешает, но может затруднить десорбцию.

Так что можно попробовать (теоретически) NaAc 0,3 М + 1 mM ЭДТА pH 6,0.


А спирт здесь не нужен ?



genseq 25.10.2014 15:50
Если теория верна, то вместо 70% спирта для отмывки БигДаев можно использовать обычную дистиллированную воду (pH 5...6). А для десорбции - Tris/HCl с pH 9...10.



genseq 25.11.2014 10:21
По данным трёх испытательных лабораторий, мелкие частицы (< 1 мкм) после сорбции ДНК плохо ресуспендируются, поэтому пришлось увеличить размеры. В последней партии силикатного сорбента (двухлитровая, 5% по сухому весу) средний диаметр частиц - 1,6 мкм при довольно узком распределении (~0,2 мкм):
Прикреплённое изображение
Сорбционные свойства вопросов не вызывают. Они проверялись неоднократно. Осталось уточнить следующие вопросы:
1. Стоит ли "округлять" размеры частиц до 1,5 мкм (спустить половину частиц в унитаз)?
2. Какое название дать этому магносорбенту?

Главное - название, поскольку "как вы яхту назовёте, так она и поплывёт" (Врунгель).

Какие будут предложения?



-Ъ- 25.11.2014 12:23
МагноГен.
Конечно можно и МагноСеком назвать smile.gif
Распределение впечатляет.



Cathie22 26.11.2014 07:14
МагноГен че-то тоже как-то... Хотя лучше МагноСека smile.gif
МагноСил, по-моему, есть уже. Силекс, само собой...
В моих складах названий есть неиспользованный УниМаг smile.gif
А не хотите просто, как на этикетке - магнитный силикагель?



genseq 27.11.2014 08:31
Спасибо за идеи. Хотелось бы, чтобы название не затерялось в Интернете, т.е. оно должно быть достаточно уникальным. По этой причине MagnoGene и UniMag не подходят:

Magnogene is a medicine available in a number of countries worldwide.
http://www.drugs.com/international/magnogene.html ( http://www.drugs.com/international/magnogene.html )

UNIMAG - это интерактивный журнал о моде, музыке, искусстве, событиях, интересных местах и персонах.
http://vk.com/unimagazine ( http://vk.com/unimagazine )

www.unimag.ua
Интернет магазин - Экологичные товары: электровелосипеды, электросамокаты, электромобили, альтернативная энергетика, спорт, туризм, здоровье, ...

Пока лидирует последнее предложение - "Магнитный силикагель". Но оно подходит только для России, в которой потенциальных потребителей такого продукта можно пересчитать по пальцам. Хотелось бы иметь ещё и англоязычный вариант названия. Не уверен, что для этого подойдёт прямой перевод - "magnetic silica gel".



Cathie22 27.11.2014 12:22
Может, СиликаМаг?



ASDF 27.11.2014 21:56
генсек, а стрептовидиновые бидсы вы готовите ?



genseq 28.11.2014 09:10
(ASDF @ 27.11.2014 19:56)
Ссылка на исходное сообщение  генсек, а стрептовидиновые бидсы вы готовите ?


Чтобы приготовить стрептавидиновые бидзы нужно купить стрептавидин. umnik.gif
А чтобы что-то купить нужно что-то продать. frown.gif



-Ъ- 28.11.2014 12:44
(genseq @ 28.11.2014 10:10)
Ссылка на исходное сообщение  Чтобы приготовить стрептавидиновые бидзы нужно купить стрептавидин. umnik.gif 
А чтобы что-то купить нужно что-то продать. frown.gif

.. или банк ограбить. tongue.gif



genseq 26.12.2014 10:02
С силикатными магносорбентами всё уже понятно. Технология получения отработана. Осталось наладить распылительную сушку. Можно и без неё, но заливать пузырьки "под завязку" нельзя, поскольку сорбент нужно суспендировать встряхиванием. Если же рассылать пузырьки с "недоливом", то они булькают, что может не понравиться девушкам на почте. При отправке по России девушек можно уговорить, но на международный рынок с "бульканьем" прорваться не удастся. frown.gif

Ещё нужно получить аналог AMPure XP (или SPRI), т.е. карбоксилированные частицы в 20% ПЭГ c 2,5 М NaCl. Карбоксилирование недавно освоил, но в первой партии частицы получились со средним диаметром 0,6 мкм. Работать должны не хуже полуторамикронных, но могут хуже ресуспендироваться после промывки этанолом и подсушивания. Придётся укрупнять. rolleyes.gif



Guest 03.01.2015 13:56
генсек, а вы cooh частицы пробовали в деле с ПЭГом? Если вам интересно я могу их потестировать на библиотеках и сравнить с АМпуром. Хотя у меня хороший запас АМпуров, они неоправданно дороги и я (да и не только я, как мне кажется) с удовольствием заменил бы их на местный продукт.



genseq 03.01.2015 17:38
Исходной задачей была именно разработка аналога AMPure. С ПЭГом пока не пробовал, поскольку для AMPure XP нужны частицы диаметром 1,5 мкм. У меня первая партия карбоксилированных частиц получилась с диаметром 0,5 мкм, а они после отмывки спиртом (если пересушить) плохо ресуспендируются. Да и примагничиваются медленнее:
Прикреплённое изображение
Надеюсь в январе разобраться с размерами частиц, закупить ПЭГ 8000 (пока есть только ПЭГ 6000) и замесить первую партию препарата. Проверять хотел сам, но за помощь в этом деле буду очень признателен. beer.gif



Guest 03.01.2015 21:10
Генсек, да я вам даже ПЕГ8000 отсыплю, ради такого дела )). Проверять лучше сначала на маркере 50 и на геномке фрагментированной, потом и библиотеку можно взять ).



ASDF 03.01.2015 21:12
ASDF



avial 04.01.2015 21:41
А для целей обычной очистки из гелей или выделения ДНК чем карбоксилированные лучше обычных силикатных? Только упрощением протокола и отсутствием органики?

А XTerminator АБИшный - это какие частицы?



genseq 06.01.2015 10:04
(avial @ 04.01.2015 19:41)
Ссылка на исходное сообщение  А для целей обычной очистки из гелей или выделения ДНК чем карбоксилированные лучше обычных силикатных? Только упрощением протокола и отсутствием органики?

А XTerminator АБИшный - это какие частицы?


Для обычной очистки ДНК из геля карбоксилированные ничем не лучше силикатных. Для выделения ДНК из таких источников как кровь, клетки и т.п. пригодны только силикатные. Карбоксилированные захватывают слишком много грязи. Преимущества карбоксилированных (осаждения ПЭГом) проявляются при очистке ДНК от дНТФ, ферментов, праймеров, праймерных димеров, а также мелких (<100...200 п.о.) и крупных (>500 п.о.) фрагментов. А это как раз то, что нужно в NGS для приготовления библиотек ДНК. Правда, ПЭГ можно заменить изопропиловым спиртом, но не всегда. С ПЭГом можно использовать и силикатные частицы, но это снижает качество очистки. Поэтому после завершения разработки силикатных частиц я даже не пытался сделать такую замену.

XTerminator - это, похоже, амфотерный ионообменник. Удаляет не только дНТФ, но и соли. Скорее всего, эпплайдовцы его усовершенствовали - покрыли ПАГом или каким-то другим мелкопористым гелем, предотвращающим связывание ДНК.



criplenie 13.01.2015 23:29
ПЭГом пцр-продукт великолепно чистится вообще без бус, но надо откручивать (попробовать можно но с бусами проще все же).

Аналог АМПура был бы полезен также тем кто занимается клонированием/мутагенезом и прочим лигированием, тут надо делать наборы и рекламироваться. Тем более при нынешнем курсе рубля.
Некотоыре извращенцы с ампуром даже плазмиды выделяют: http://openwetware.org/wiki/Lane:MagneticPlasmidPrep ( http://openwetware.org/wiki/Lane:MagneticPlasmidPrep )

Вот кстати еще идейка для набора: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002....25257/abstract ( http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bit.25257/abstract )



criplenie 13.01.2015 23:38
(genseq @ 03.01.2015 18:38)
Ссылка на исходное сообщение
Надеюсь в январе разобраться с размерами частиц, закупить ПЭГ 8000 (пока есть только ПЭГ 6000) и замесить первую партию препарата. Проверять хотел сам, но за помощь в этом деле буду очень признателен. beer.gif

Я с 6000 делал (и с ацетатом аммония вышло лучше чем с NaCl). Правда через полгода похоже растворчик окислился и теперь ингибирует ПЦР. Но первый месяц все работало.



genseq 21.05.2015 16:38
Расфасовал последнюю партию силикатного магносорбента. Получилось три десятка пузырьков по 20 мл "магнитного силикагеля" (5% w/v; 25% v/v). Однако, партия! wink.gif
Прикреплённое изображение
http://magno.ucoz.com/index/silica/0-6 ( http://magno.ucoz.com/index/silica/0-6 )



-Ъ- 21.05.2015 17:15
(genseq @ 21.05.2015 17:38)
Ссылка на исходное сообщение  Расфасовал последнюю партию силикатного магносорбента. Получилось три десятка пузырьков по 20 мл "магнитного силикагеля" (5% w/v; 25% v/v). Однако, партия! wink.gif

Пирамидкой красиво лежат, созревают, как вино. Беру. smile.gif



genseq 25.05.2015 09:35
(-Ъ- @ 21.05.2015 15:15)
Ссылка на исходное сообщение  Пирамидкой красиво лежат, созревают, как вино. Беру. smile.gif


Они не лежат, а стоят. Это вид сверху.

Одна девушка просила дать на пробу немного магносорбента. Предлагал отправить по почте, но она хочет забрать лично, причём именно у тебя. wink.gif
Если не возражаешь, на этой неделе привезу "пирамидку" к тебе (для раздачи девушкам). Для серьёзных потребителей на днях приготовлю ещё пару литров. Флаконы для неё (20 шт. на 100 мл) вчера заказал в Китае. Пора увеличивать объёмы производства. shuffle.gif



genseq 29.05.2015 09:56
Партию магносорбента отвёз в Москву. Желающие испытать и поделиться впечатлениями могут получить флакон (20 мл, 5%) бесплатно. Запросы - по E-mail или через сайт:
http://magno.ucoz.com/ ( http://magno.ucoz.com/ )



ASDF 29.05.2015 11:48
Генсек, а вы сами то их тестировали? Что чистили ? ПЦР фрагменты ? или может РНК? Опять же буферы вы предлагаете самостоятельно делать?



avial 29.05.2015 13:21
user posted image

Из 200 мкл цельной крови в 200 мкл воды (или ТЕ - тут не уверен), растворы почти без изменений взяты от колонок, 260/230 из-за плохо отмытого гуанидина.
Работают частицы.



wyzandrea123 02.06.2015 10:31
RNAi ( http://www.creative-animodel.com/Animal-Model-Development/Knockdown-Services.html )?



genseq 18.10.2015 12:00
Подтвердилась теория хемосорбции ДНК/РНК на силикатах (пп.6,7) smile.gif :
http://magno.ucoz.com/index/silica/0-6 ( http://magno.ucoz.com/index/silica/0-6 )
Исходя из неё причиной высокой специфичности связывания нуклеиновых кислот на таких сорбентах является образование связей Si-O-P при pH<7, гидролизующихся в щелочных условиях.
Оказывается, специалистам эта реакция давно известна. Вот что ответила на моё письмо ведущая специалистка Института химии силикатов Т.А.Кочина:
В принципе, в пп. 6 и 7 все изложено. Хемосорбция поверхностью силикагеля соединений фосфора была описана еще в 1971году. На первой стадии происходит замещение силанольных групп SiOH, которые всегда присутствуют на поверхности силикагеля, на Si-O-P, т.е. происходит прививка фосфорсодержащих соединений к поверхности силикагеля (хемосорбция). При последующем гидролизе происходит расщепление привитых групп Si-O-P с образованием групп P-OH и Si-OH (десорбция). Скорость гидролиза возрастает с увеличением рН среды.



Sileks 12.12.2015 03:05
Уважаемые форумчане, давно слежу за форумом и рассуждениями по поводу магнитных частиц и о проблемах, связанными с ними. В конце концов решил написать, так как в рассуждениях, высказывающихся на форуме, достаточно много ошибок и заблуждений. С вашего разрешения я изложу суть проблемы так, как я, в качестве производителя наборов с использованием магнитных частиц, вижу эту проблему.

1. Почему магнитные частицы
способностью сорбировать нуклеиновые кислоты, белки обладают огромное количество материалов начиная от металлов и не только металлов, их оксидов, сложных органических молекул и много-много других. Силика оказалась, что называется под рукой. Самой дешевой и достаточно эффективной. Комбинирование силикатного покрытия с магнитной основой просто логическое продолжение хорошо отработанного метода, дающее преимущество собирать частицы из большого объема без использования центрифуги. Сегодня существуют частицы с совершенно разными покрытиями, позволяющие избирательно выделять нуклеиновые кислоты или белки с определенными свойствами, характеристиками и размерами.

2. Почему каждый не синтезирует свои частицы
синтез магнитных частиц с любыми покрытиями при небольшой затрате времени можно найти в бесконечных количествах статей. Сегодня некоторые из таких частиц может синтезировать даже школьник у себя дома на кухне. Это не особенно сложно. И самое замечательное - эти частицы будут что-то выделять. Но основная проблема - приспособить частицы для конкретной задачи. И вот тут начинается та работа за которую наши уважаемые клиенты платят свои деньги. Частицы являются таким же компонентом набора, как и соли, и другие компоненты. Сами по себе они ничто. Только вместе с правильно подобранными компонентами в нужных соотношениях и последовательностях их использования достигается конечный эффект. Так что можно сказать, клиент покупает не магнитные частицы, а ноу-хау по их использованию. И в результате набор становится системой, позволяющей стандартизовать процедуру. Это очень важно при выделении из большого количества образцов, чтобы результат был воспроизводим и его можно было сопоставить с предыдущими результатами.

3. зачем переплачивать за чужие наборы
в любой работе каждый для достижения результата выбирает одно из двух - время или деньги. Если вам нужно быстро получить результат, а не осваивать азы по лабораторному практикуму - вы покупаете набор, выполняете работу, публикуетесь, становитесь известными в своей области, получаете гранты и работаете дальше. Если у вас нет денег и есть много времени, то вы вникаете в детали процедур, набиваете шишки и ломаете ноги о подводные камни и рано или поздно вы все будете знать, что и как должно быть в любом наборе и, может быть, откроете свою собственную фирму. Что выбирать - решать вам.

4. и все-таки, из чего состоят буфера для выделений
из разных компонентов. На разработку буферов уходит масса времени. Если кто-то на форуме пишет, что он понюхал и там 100% этанол, изопроп и т.д., а в буфере таком-то наверняка гуанидин, могу вам с почти 100% уверенностью сказать - в мясной сосиске есть мясо. Лучший способ узнать правду и получить правильный совет - не спрашивать на форумах, а обратиться к производителю. Если сможет - ответит. Если не сможет, по крайней мере не будет вводить в заблуждение.

Желаю всем успехов!



blij 12.12.2015 04:14
(Sileks @ 12.12.2015 02:05)
Ссылка на исходное сообщениеЛучший способ узнать правду и получить правильный совет - не спрашивать на форумах, а обратиться к производителю. Если сможет - ответит. Если не сможет, по крайней мере не будет вводить в заблуждение.

Лучший способ узнать загадочный состав - посмотреть список патентов, которые перечисляются в описании продукта. По кр. мере можно узнать в каком направлении копать. Спрашивать производителя - пустая трата времени и свидетельство потрясающей детской наивности вопрошающего.



пацанчег 12.12.2015 12:42
Аминь, брат.



genseq 31.05.2016 09:06
Как показало изучение монографии отечественных авторов (М.Г. Воронков, Е.А. Малетина, В.К. Роман. Кремнекислородные соединения неметаллов : производные азота и фосфора. 1998 г., 360 с.) , соединения со связями P-O-Si описаны во множестве публикаций. Так что хемосорбция ДНК силанолами сомнений не вызывает. Но в сорбции могут принимать участие и водородные связи силанольных групп с аминами и амидами. Сорбция амидов тоже не вызывает сомнений, поскольку этот тип связей неплохо изучен в связи с изучением флокулирующих свойств полиакриламида, широко используемого в водоочистке.
Исходя из этих литературных данных попытался приготовить частицы с полиакриламидным покрытием, пропитанным поликремниевой кислотой. Пробный вариант отличался повышенным дзета-потенциалом. Повысилась и сорбционная ёмкость. Оседают частицы "полиакриламидного силикагеля" не быстрее обычных, но диаметр увеличился примерно в 2 раза - до 2...3 мкм. Осталось проверить влияние сроков хранения. Если через год свойства не ухудшатся, то начну ими приторговывать. wink.gif
Прикреплённое изображение



Файл/ы:

Скачать файл Lot_5___17.05.2016_2.pdf
Размер:: 206.06к
кол-во скачиваний: 131




Panaev 31.05.2016 11:34
(blij @ 12.12.2015 05:14)
Ссылка на исходное сообщение  Лучший способ узнать загадочный состав - посмотреть список патентов, которые перечисляются в описании продукта. По кр. мере можно узнать в каком направлении копать. Спрашивать производителя - пустая трата времени и свидетельство потрясающей детской наивности вопрошающего.


Не все так категорично. За спрос денег не берут, но иногда отвечают искренне. Прецеденты были. Конечно, не всегда.



genseq 04.09.2016 09:33
(Guest @ 03.01.2015 11:56)
Ссылка на исходное сообщение  генсек, а вы cooh частицы пробовали в деле с ПЭГом? Если вам интересно я могу их потестировать на библиотеках и сравнить с АМпуром. Хотя у меня хороший запас АМпуров, они неоправданно дороги и я (да и не только я, как мне кажется) с удовольствием заменил бы их на местный продукт.


Dear ASDF,
прошу прощения за то, что переключился с разработки AMPure RU на обзоры и проекты по NGS. Обязуюсь до конца года вывести на рынок первую партию данного препарата, отличающегося от всех прочих аналогов особо низкой ценой и высоким качеством. Тем более, что деньги на реактивы появились. Спрос на магнитные штативы и сорбенты понемногу растёт. wink.gif



-Ъ- 05.09.2016 11:06
Генсек камень точит. smile.gif
1 М хлорид натрия уже сам по себе антисептик. Но как среда для шариков - не помеха. Хотел сказать, что азид можно уже не добавлять. На своих добавляю побольше азида (до 0,1%) и держу рН ниже 8.
Про сроки хранения понятно (что может произойти со стеклом), но таки советую дать один год (для тебя же лучше - больше будут покупать. wink.gif



genseq 05.09.2016 13:15
(-Ъ- @ 05.09.2016 09:06)
Ссылка на исходное сообщение  Генсек камень точит. smile.gif
1 М хлорид натрия уже сам по себе антисептик. Но как среда для шариков - не помеха. Хотел сказать, что азид можно уже не добавлять. На своих добавляю побольше азида (до 0,1%) и держу рН ниже 8.
Про сроки хранения понятно (что может произойти со стеклом), но таки советую дать один год (для тебя же лучше - больше будут покупать. wink.gif


Спасибо за дельные советы. Правда, с азидом всё не так просто. В магносорбенты он добавляется не столько для устранения прорастания, сколько для блокировки окисления магнетита. Правда, у меня частички и без него покрыты фосфатом, но азид, по крайней мере теоретически, может пролезать в "промежности", недоступные для фосфатов.
С pH ситуация понемногу проясняется. Оказалось, что сорбционные свойства зависят от дзета-потенциала, а он в щелочной среде понемногу снижается. В кислой среде перегруппировки силанольных связей не идут, поэтому дзета-потенциал намного стабильнее. Посему препараты теперь подкисляю. Нужно бы поставить серию экспериментов по оценке влияния pH на стабильность дзета-потенциала при длительном хранении, но своего прибора не имею, а заказывать такую серию накладно.



-Ъ- 05.09.2016 13:51
Заложи на хранение сорбенты в разной среде и рН и оценивай периодически по конечному показателю - выделению ДНК из какого нибудь стандартного образца. Я не мудрствуя моделирую с чистой ДНК фага лямбда, а следом - из крови.
А что есть дзетта потенциал даже не заморачиваюсь.
Ну конечно если это надо публиковать в Натуре... smile.gif wink.gif



genseq 27.10.2016 20:32
Сорбенты закислил. Азид не стал добавлять, поскольку при закислении он даёт летучую адотистоводородную кислоту, по токсичности ненамного уступающую синильной. Бутыли по 0,5 л заложил на хранение. Частицы сделал разного размера - ~0,75 мкм, ~1,5 мкм и ~2,5 мкм. Через пол года буду сравнивать их сорбционную ёмкость. wink.gif
Приятно работать, когда никто не торопит. wink.gif



-Ъ- 27.10.2016 21:35
(genseq @ 27.10.2016 21:32)
Ссылка на исходное сообщение  
Приятно работать, когда никто не торопит.  wink.gif

Это точно!
А когда голова не болит где бы деньги достать на приятный отпуск... зимой umnik.gif - это ващеее. wink.gif



genseq 20.12.2016 19:36
(genseq @ 04.09.2016 07:33)
Ссылка на исходное сообщение  Dear ASDF,
прошу прощения за то, что переключился с разработки AMPure RU на обзоры и проекты по NGS. Обязуюсь до конца года вывести на рынок первую партию данного препарата, отличающегося от всех прочих аналогов особо низкой ценой и высоким качеством. Тем более, что деньги на реактивы появились. Спрос на магнитные штативы и сорбенты понемногу растёт. wink.gif


В сентябре имел неосторожность пообещать доделать AMPure RU. Тогда конец года казался очень далёким. Обещание выполнил, но только частично. Конечного продукта до сих пор нет. Зато удалось получить карбоксилированный магносорбент с диаметром частиц как у AMPure XP - 1,5 мкм. Причём по очень простой технологии. После Нового Года займусь масштабированием его производства и подбором рецептуры для стабилизации ПЭГ. Главное - не торопиться. Тем более, что торопиться некуда. wink.gif



-Ъ- 21.12.2016 10:53
(genseq @ 20.12.2016 20:36)
Ссылка на исходное сообщение  В сентябре имел неосторожность пообещать доделать AMPure RU. Тогда конец года казался очень далёким. Обещание выполнил, но только частично. Конечного продукта до сих пор нет. Зато удалось получить карбоксилированный магносорбент с диаметром частиц как у AMPure XP - 1,5 мкм. Причём по очень простой технологии. После Нового Года займусь масштабированием его производства и подбором рецептуры для стабилизации ПЭГ. Главное - не торопиться. Тем более, что торопиться некуда.  wink.gif

Это в каком смысле стабилизировать?



genseq 21.12.2016 12:15
(-Ъ- @ 21.12.2016 08:53)
Ссылка на исходное сообщение  Это в каком смысле стабилизировать?


Это в смысле подобрать анитоксиданты и т.п., которые замедлят или устранят накопление всякой гадости, образующейся при хранении растворов ПЭГ.
Немного информации на эту тему есть здесь:
http://magno.ucoz.com/index/ampure_xp/0-8 ( http://magno.ucoz.com/index/ampure_xp/0-8 )



-Ъ- 21.12.2016 12:44
(genseq @ 21.12.2016 13:15)
Ссылка на исходное сообщение  Это в смысле подобрать анитоксиданты и т.п., которые замедлят или устранят накопление всякой гадости, образующейся при хранении растворов ПЭГ.
Немного информации на эту тему есть здесь:
http://magno.ucoz.com/index/ampure_xp/0-8 ( http://magno.ucoz.com/index/ampure_xp/0-8 )

В качестве антиоксидантов, не открывая америку: меркаптоэтанол, DTT, серосодержащую аминокислоту...
А в качестве консерванта, если рН позволяет (кстати, какой?), азида и проклинчика.
Хотя сомневаюсь, что нужна ли вообще стабилизация в среде с 2-3 М NaCI.



genseq 07.03.2017 11:06
Сегодня на сайте http://magno.ucoz.com/ ( http://magno.ucoz.com/ ) счётчик насчитал 4000 посещений со дня его основание. В связи с юбилеем хотелось бы подвести некоторые итоги.

1. Налажен синтез силикатных магносорбентов. Не уверен, что лучших в мире, но уверен, что не худших. А по стоимости - самых дешёвых (20 мл 5% концентрата - 6 тыс. руб.). jump.gif
2. Разработана технология синтеза карбоксилированных магносорбентов. Выход магнитных частиц у неё в 5 раз меньше, чем у силикатных. Но если концентрат доводить до 1 % (по сухому весу), а не до 5% (как у силикатных), то конечный объём получится такой же - около 0,5 л за один цикл приготовления. Причём технология легко масштабируется, так что можно получать концентрат и литрами. wink.gif
3. Пора браться за главное - за разработку AMPure RU. Поэтому "прошерстил" литературу по накоплению перекисных соединений в эфирах (к которым относится и ПЭГ). Картинка начинает проясняться. Но однозначное решение отсутствует, поэтому со стабилизацией ПЭГ придётся поэкспериментировать. Надеюсь, что уже на следующей неделе. wall.gif



Vadim Sharov 02.09.2017 23:03
Вполне доморощенное магнитное (3D биопринтер российский)
http://www.biohab.ru/index.php?/topic/968-...ge-2#entry13311 ( http://www.biohab.ru/index.php?/topic/968-3d-печать-органов/page-2#entry13311 )



genseq 27.10.2017 17:51
Наконец-то всё готово для приготовления AMPure RU. jump.gif
Банка с особо чистым ПЭГ8000 лежит давно. Чистый (хч) NaCl получил на прошлой неделе. Вчера на почте забрал посылку с главным антиоксидантом - эктоином. Обычно ограничиваются добавлением одного азида натрия, но он плохо ловит супероксидные радикалы. Карбоксилированные частицы магнетита окислил до гамма-гематита, чтобы свести к минимуму их окисление, и выдержал около полугода. Мелких примесей в этой партии нет совсем. Есть примесь крупных частиц, но её убрать совсем не сложно. Основная фракция идеально ложится в оптимальный диапазон (~1,5 мкм). Осталось только перемешать всё это в нужных пропорциях.
Прикреплённое изображение
На следующей неделе буду готов обеспечить всех желающих пробными образцами. Заявки на пробники можно присылать через форму обратной связи на сайте magnoshop.ru:
http://magnoshop.ru/index/obratnaja_svjaz/0-10 ( http://magnoshop.ru/index/obratnaja_svjaz/0-10 )



-Ъ- 30.10.2017 13:12
(genseq @ 27.10.2017 18:51)
Ссылка на исходное сообщение  Наконец-то всё готово для приготовления AMPure RU. jump.gif 
Банка с особо чистым ПЭГ8000 лежит давно. Чистый (хч) NaCl получил на прошлой неделе. Вчера на почте забрал посылку с главным антиоксидантом - эктоином.

Это с каких пор эктоин стал антиоксидантом?
Стабилизирующее влияние оказывает, но в данном случае, как бы сказать, - не в кассу. Как возникло такое решение?



genseq 30.10.2017 18:04
Эктоин известен как один из лучших космотропов (противоположность хаотропов), но лично у меня его антиоксидантные свойства сомнений не вызывают. Это следует из его формулы. Но есть и публикации, подтверждающие его UV-защитные и радиопротекторные свойства umnik.gif :



Файл/ы:

Скачать файл Ectoin_DNA_pH_2017.pdf
Размер:: 2.27мб
кол-во скачиваний: 21



Скачать файл Ectoin_2017_DNA.pdf
Размер:: 5.37мб
кол-во скачиваний: 20




-Ъ- 30.10.2017 19:01
В глазных каплях, в защитных кремах от УФ эктоин давно используется. Лишним компонентом возможно не будет в твоих суспензиях шириков, но точно не защитит от:
- зацветания среды,
- гидролиза и пр. модификации функциональных групп,
- ну и окисления тоже, конечно.
Протекторные свойства эктоина, в отличие от того же DTT, имеют совсем другую природу.
А может тебе повезет, и на небосклон взойдет суперзвезда! beer.gif



genseq 30.10.2017 19:40
(-Ъ- @ 30.10.2017 17:01)
Ссылка на исходное сообщение  В глазных каплях, в защитных кремах от УФ эктоин давно используется. Лишним компонентом возможно не будет в твоих суспензиях шириков, но точно не защитит от:
- зацветания среды,
- гидролиза и пр. модификации функциональных групп,
- ну и окисления тоже, конечно.
Протекторные свойства эктоина, в отличие от того же DTT, имеют совсем другую природу.
А может тебе повезет, и на небосклон взойдет суперзвезда! beer.gif


Зацветание "среды" (20% ПЭГ8000, 2,5М NaCl, 0,1% азида натрия) меня не волнует. Волнует разрыв эфирных связей ПЭГа, который приводит к образованию концевых радикалов. А они незамедлительно реагируют с кислородом и образуют перекисные соединения. Перекиси реагируют со следами железа с выделением активных форм кислорода, в том числе свободных гидроксильных и супероксидных радикалов. Гидроксильные быстро окисляют первые попавшиеся молекулы и быстро нейтрализуются, например, азидом. А вот супероксидные в слабощелочной среде накапливаются и из-за отрицательного заряда с азидными анионами практически не реагируют. Зато хорошо реагируют с положительно заряженными группами. Поэтому и нужен эктоин, у которого имеется положительно заряженная и легко реагирующая с супероксидом группа N=C. rolleyes.gif
Хотя в действительности всё может быть совсем не так, как на самом деле. wink.gif



genseq 08.12.2017 20:29
Сегодня замесил первую партию (0,5 л) AMPure RU (т.е. AMPure XP отечественного разлива). beer.gif

Состав:
20% ПЭГ8000;
2,5М NaCl;
10 мМ Tris*HCl (pH 8,0);
0,1% азида натрия;
0,2% эктоина;
0,2% гематитного магносорбента (-COOH; средний размер частиц 1,2 мкм).

Осталось расфасовать. Пузырьки в наличии только на 30 мл, так что пробники получатся по 25 мл (19...20 флаконов). Как показал ранее приобретённый опыт, бесплатно раздавать пробники нет смысла. Так что собираюсь их продавать по 1000 руб. (в рекламных целях, с курьерской доставкой, оплата по безналу). Могу отдать и бесплатно, но за рецензию. Не обязательно (но желательно) хорошую. wink.gif

Заявки можно оставлять прямо здесь.
Или здесь: http://magnoshop.ru/index/obratnaja_svjaz/0-10 ( http://magnoshop.ru/index/obratnaja_svjaz/0-10 )

Если отзывы будут положительными, то после Нового года начну приторговывать этой коричневой жижей. shuffle.gif



Tom1 08.12.2017 21:58
(genseq @ 08.12.2017 10:29)
Ссылка на исходное сообщение  Сегодня замесил первую партию (0,5 л) AMPure RU (т.е. AMPure XP отечественного разлива).  beer.gif
 
Состав:
20% ПЭГ8000;
2,5М NaCl;
10 мМ Tris*HCl (pH 8,0);
0,1% азида натрия;
0,2% эктоина;
0,2% гематитного магносорбента (-COOH; средний размер частиц 1,2 мкм).

Осталось расфасовать. Пузырьки в наличии только на 30 мл, так что пробники получатся по 25 мл (19...20 флаконов). Как показал ранее приобретённый опыт, бесплатно раздавать пробники нет смысла. Так что собираюсь их продавать по 1000 руб. (в рекламных целях, с курьерской доставкой, оплата по безналу). Могу отдать и бесплатно, но за рецензию. Не обязательно (но желательно) хорошую.  wink.gif

Заявки можно оставлять прямо здесь.
Или здесь: http://magnoshop.ru/index/obratnaja_svjaz/0-10 ( http://magnoshop.ru/index/obratnaja_svjaz/0-10 )

Если отзывы будут положительными, то после Нового года начну приторговывать этой коричневой жижей. shuffle.gif

Старик нелья быть таким меркантильным Кю....
wink.gif



genseq 09.12.2017 09:49
(Tom1 @ 08.12.2017 19:58)
Ссылка на исходное сообщение  Старик нелья быть таким меркантильным Кю....
wink.gif


Дело не в меркантильности. Если из рук в руки, то передам бесплатно.beer.gif
Если отправлять через ТК с курьерской доставкой или по почте, то моей зарплаты на это не хватит. frown.gif
Тем более, что исходные реактивы не были бесплатными. shuffle.gif

Если всё-таки считаете, что 1000 руб. за 25 мл это многовато, то пишите в личку. Договоримся. wink.gif
Или обращайтесь к конкурентам. У них есть бесплатные пробники по 1 мл, но только до конца года. Или флаконы по 5 мл подобного препарата ("SR DNA beads"), но за 8200 руб.:
http://seqrus.ru/ ( http://seqrus.ru/ )



avial 11.12.2017 13:18
А секрус - это кто? В каком институте?



genseq 28.12.2017 11:56
(avial @ 11.12.2017 11:18)
Ссылка на исходное сообщение  А секрус - это кто? В каком институте?


Не знаю (но догадываюсь).

После праздников собираюсь провести рекламную акцию для продвижения AMPure RU. Сам я его ещё не проверял, но предоставлю по флакону (25 мл) любому, кто пообещает провести проверку. Бесплатно могу разослать десяток флаконов.

Заявки принимаются через форму обратной связи или по E-mail:
http://magnoshop.ru/index/obratnaja_svjaz/0-10 ( http://magnoshop.ru/index/obratnaja_svjaz/0-10 )
http://magnoshop.ru/ ( http://magnoshop.ru/ )

После проверки сторонними экспертами или займусь доработкой и устранением выявленных недостатков (если они обнаружатся), или включу AMPure RU в каталог продукции. Ориентировочная цена - 6000 руб./25 мл (в 5...6 раз дешевле, чем у конкурентов). wink.gif

С наступающим Новым годом! beer.gif beer.gif beer.gif



-Ъ- 28.12.2017 18:49
Генсек, ты неисправим! Этого мало что ты бесплатно даешь свой сорбент для испытаний, no.gif ты еще должен заплатить за эти испытания, но уже другие деньги, уже немалые. tongue.gif Даже если твой сорбент далее будет нужен непосредственному "испытателю".
И потом, ты своим "5-6 раз дешевле" рубишь на корню всю свою любимую деятельность - или ты воруешь чтоб так дешево было, или просто "пиаришься", говоря на новом русском... umnik.gif Дешевле должно быть всего на 3 копейки, ну не намного, ну чтоб заметили что дешевле чуть-чуть. Учу тебя, учу no.gif
Пардон, конечно, но поверь более опытному "Ъ". smile.gif



criplenie 29.12.2017 13:56
(genseq @ 28.12.2017 12:56)
Ссылка на исходное сообщениевключу AMPure RU в каталог продукции.

А не слишком палевное название? Могут и засудить. Лучше что-нибудь типа Amplipure, PCRpure, CarboPure (вот до этого точно никто не додумался) и т.д.



Tom1 29.12.2017 18:50
(-Ъ- @ 28.12.2017 08:49)
Ссылка на исходное сообщение  Генсек, ты неисправим! Этого мало что ты бесплатно даешь свой сорбент для испытаний, no.gif  ты еще должен заплатить за эти испытания, но уже другие деньги, уже немалые. tongue.gif  Даже если твой сорбент далее будет нужен непосредственному "испытателю".
И потом, ты своим "5-6 раз дешевле" рубишь на корню всю свою любимую деятельность - или ты воруешь чтоб так дешево было, или просто "пиаришься", говоря на новом русском... umnik.gif Дешевле должно быть всего на 3 копейки, ну не намного, ну чтоб заметили что дешевле чуть-чуть. Учу тебя, учу no.gif
Пардон, конечно, но поверь более опытному "Ъ". smile.gif

Пухлик ты чо так возбудился?????
Ну хочется челу, ну и пусть себе....
все равно ханьцев он не переплюнет...)))



genseq 30.12.2017 10:56
(-Ъ- @ 28.12.2017 16:49)
Ссылка на исходное сообщение   ты еще должен заплатить за эти испытания, но уже другие деньги, уже немалые. tongue.gif  Даже если твой сорбент далее будет нужен непосредственному "испытателю".
... - или ты воруешь чтоб так дешево было, или просто "пиаришься"


1. Сначала попытаюсь испытать без денег. Если не получится, то придётся испытывать за деньги. При их отсутствии - испытывать самому. frown.gif
2. Реактивы не ворую. Покупаю на деньги, полученные от продажи магнитных штативов и силикатного магносорбента. rolleyes.gif
3. Дёшево потому, что самый дорогой компонент - карбоксилированные бидзы - наловчился делать своими руками. И теперь их нужно пиарить. wink.gif

(criplenie @ 29.12.2017 11:56)
Ссылка на исходное сообщение  А не слишком палевное название? Могут и засудить. Лучше что-нибудь типа Amplipure, PCRpure, CarboPure (вот до этого точно никто не додумался) и т.д.


Название"стрёмное", но понятное для всех, кто в России занимается NGS. Если прорываться за бугор, то придётся что-то придумывать. Кстати, спасибо за идею (AmpliPure). У этого названия только один недостаток - оно не подходит для поиска в Интернете. Нужно придумать что-нибудь уникальное. Какие будут предложения? confused.gif



criplenie 02.01.2018 19:16
(genseq @ 30.12.2017 11:56)
Ссылка на исходное сообщение
Название"стрёмное", но понятное для всех, кто в России занимается NGS. Если прорываться за бугор, то придётся что-то придумывать. Кстати, спасибо за идею (AmpliPure). У этого названия только один недостаток - оно не подходит для поиска в Интернете. Нужно придумать что-нибудь уникальное. Какие будут предложения?  confused.gif

Ну занимающиеся NGS в России это достаточно узкая группа и на ней далеко не уедешь. Подобные частицы могли бы пригодиться и при очистке обычных пцр продуктов или скажем рестриктов при клонировании. А это сразу увеличивает число потенциальных покупателей в три-четыре раза. Для зарубежных же покупателей надо что-нибудь новое придумать, например подобрать условия для очистки фрагментов длиной больше 10 килобаз для оксфорднанопора.
По поводу названия, пробовал искать - amplipure magnetic, выдача пустая.



avial 03.01.2018 23:22
AMPure RU вместе с растворами на тесты даются?



R-J-Dio 04.01.2018 12:32
Евроген все уже за вас порешал, генсек, расслабьтесь, место занято в лучшем виде, и со штативчиками токмо



genseq 04.01.2018 21:09
(avial @ 03.01.2018 21:22)
Ссылка на исходное сообщение  AMPure RU вместе с растворами на тесты даются?


О каких растворах идёт речь?
Для очистки ДНК нужно добавить к препарату равный объём AMPure RU, осадить магносорбент с ДНК на магнитном штативе, промыть осадок 70...80% этанолом, слегка подсушить, суспендировать в TE или в любом другом удобном для дальнейшей работы буфере и удалить магносорбент всё тем же магнитным штативом.

(R-J-Dio @ 04.01.2018 10:32)
Ссылка на исходное сообщение  Евроген все уже за вас порешал, генсек, расслабьтесь, место занято в лучшем виде, и со штативчиками токмо


Реагент, предлагаемый Еврогеном (CleanMag DNA), стоит 31500 руб./25 мл. Причём к препарату ДНК он добавляется в двойном объёме. Т.е. этот реагент примерно в 10 раз дороже AMPure RU.

В этом деле главное - это качество. Но если качество не будет вызывать сомнений, то главной становится цена. Так что Евроген в данном случае конкурировать не сможет. smile.gif



bio101 04.01.2018 22:26
конечно, не конкурент. нельзя быть конкурентом тому, чего нет на рынке. а цена... по сравнению-а ведь больше сравнивать не с чем- с импортными аналогами вполне щадящая. народ уже полюбил



avial 04.01.2018 22:58
Нет, я в варианте для библиотек имел в виду - отдельно частицы с растворами на тесты даются?



genseq 05.01.2018 09:29
(avial @ 04.01.2018 20:58)
Ссылка на исходное сообщение  Нет, я в варианте для библиотек имел в виду - отдельно частицы с растворами на тесты даются?


Естественно. Так и было задумано:
http://magnoshop.ru/index/ampure_xp/0-8 ( http://magnoshop.ru/index/ampure_xp/0-8 )



avial 05.01.2018 23:15
Ок, мы возьмем на тесты, чуть позже в личку напишу.
Интересует именно size-select, очистка в меньшей степени.



genseq 19.02.2018 08:21
Похоже, технологию производства силикатного магносорбента удалось довести до совершенства:
1. Магнетит заменён маггемитом, который не содержит двухвалентного железа и, соответственно, не плодит свободные радикалы.
2. Появилась возможность регулировать средний диаметра частиц, причём практически без снижения выхода целевого продукта.
3. Выход магнитного силикагеля повышен до 2...3 литров концентрата (5% w/v или ~50% v/v) в месяц.

Теперь можно полностью переключиться на совершенствование AMPure RU. Пробные образцы (по 25 мл) рассылаю бесплатно, но только в пределах РФ и ближнего зарубежья. В дальнее забугорье тоже могу передать, но только с оказией. wink.gif



genseq вчера, 10:04
Недавно (17.05.2018) на выставке конференции NGS-2018 компания ГенТерра рекламировала силикатный магносорбент EXTRAGEN. Похоже, рекламировать начали совсем недавно, поскольку на сайте компании информация о нём отсутствует:
http://www.genterra.ru/ ( http://www.genterra.ru/ )

Раздавали проспекты и даже бесплатные образцы (по 1 мл). Частички мелковаты (около 1 мкм), но, насколько я понял, вполне работоспособны. Пока нашёл у них только один недостаток - цена (150 тыс. руб./500 мл при 2,5% w/v). Это в полтора раза дороже моих (100 тыс. руб./500 мл при 5% w/v), но если учитывать в 2 раза меньшую концентрацию, то стоят они в 3 раза дороже:
http://magnoshop.ru/index/magnosorbenty/0-21 ( http://magnoshop.ru/index/magnosorbenty/0-21 )



avial вчера, 11:14
Ну могу сказать, что AMPure RU тоже работают, с почищенных ампликонов получены вполне себе нормальные сиквенсы.





Powered by Invision Power Board (http://www.invisionboard.com)
© Invision Power Services (http://www.invisionpower.com)