Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
менделеев05 |
Белок ( фермент) - ДНК-связывающий. Есть какие-либо методы ? Сообщение было отредактировано менделеев05 - 10.02.2013 02:23 |
yack moderator Москва, Россия |
Или ЭДТА + низкий pH и на что-нибудь типа CM/SP Голубой цибракон еще попробовать можно, но всегда есть риск, что там все и останется Но я подозреваю, что дъявол как обычно таится в деталях |
менделеев05 |
|
guest: ммм IP-штамп: frQlBxj4iQSg. гость |
|
guest: ммм IP-штамп: frQlBxj4iQSg. гость |
|
yack moderator Москва, Россия |
Насчет условий и денатурации ммм все доступно объяснил. Об этом подробнее Вы сможете прочитать в нашем новом иллюстрированном журнале "А хрен его знает"
|
serhiosus Участник Minsk |
|
менделеев05 |
|
Guest IP-штамп: frYmGqvvNujjc гость |
|
-Ъ- Постоянный участник Москва |
(serhiosus @ 10.02.2013 20:05) если pI белка выше 7, то можно пробывать анионообменники ( рН 7-7.5, ДНК садится, а белок нет). Тут надо играть с рН и ионной силой в растворе. Например в случае с рядом полимераз это проходит (опробовано). Думаю, что даже если белок садиться на смолу - подобрав условия элюции можно отбиться. Либо обратная ситуация, как писали выше - катионообменник (белок садиться, ДНК в проскоке). Правда тут вопрос насколько надо очистить белок от ДНК - таким способом скорее всего не получиться полностью избавиться от нуклеинки. Тогда ДНКаза. А как от ДНК-азы избавляться? Еще одну дополнительную колонку ставить? ДНК-аза - большее зло в ДНК полимеразах и в неполимеразах, чем следы ДНК. Сообщение было отредактировано -Ъ- - 11.02.2013 10:53 |
xenopus Постоянный участник Moscow |
|
Tom1 Постоянный участник |
правильно " петрович" спросил чо за протеин, он чо так крепко связан с НК что в процессе екстрагирования из клетки не отскакивает ( интересно самому стало что за фермент) имха прежде чем вопрошать аффтар мог бы посмотреть литературу, а вот если после сего возникли вопросы конкретно спросить.... пы.сы. голубая, ГАП, гепарин ... - ФОСФОЦЕЛЛЮЛОЗА!!! вот наш выбор.... |
abdula Постоянный участник |
(Tom1 @ 11.02.2013 16:54) право слово странно было читать и саму тему и коменты.... правильно " петрович" спросил чо за протеин, он чо так крепко связан с НК что в процессе екстрагирования из клетки не отскакивает ( интересно самому стало что за фермент) имха прежде чем вопрошать аффтар мог бы посмотреть литературу, а вот если после сего возникли вопросы конкретно спросить.... пы.сы. голубая, ГАП, гепарин ... - ФОСФОЦЕЛЛЮЛОЗА!!! вот наш выбор.... ну и как отделить рекомбинантную Так полимеразу от ДНК кишечний палочки ? |
менделеев05 |
гепариновая колонка и ионообменная хроматография не помогают. с помощью антибиотика реально очистить белок ( от каких-либо примесей или от той самой ДНК ) ? Сообщение было отредактировано менделеев05 - 12.02.2013 00:26 |
abdula Постоянный участник |
(менделеев05 @ 12.02.2013 01:25) название фермента не скрываю - Лон -протеаза. гепариновая колонка и ионообменная хроматография не помогают. с помощью антибиотика реально очистить белок ( от каких-либо примесей или от той самой ДНК ) ? не очен понятна степен очистки ? какие тесты на наяличие днк ? и какого днка в протеаязе ? |
abdula Постоянный участник |
(менделеев05 @ 12.02.2013 01:25) название фермента не скрываю - Лон -протеаза. гепариновая колонка и ионообменная хроматография не помогают. с помощью антибиотика реально очистить белок ( от каких-либо примесей или от той самой ДНК ) ? зачем протеазу чистить от хоста ? |
менделеев05 |
зачем чистить?- чтобы проверить насколько днк все-таки влияет на сам белок и на его степень олигомеризации ( да и вообще для чего она ферменту нужна) |
abdula Постоянный участник |
(менделеев05 @ 12.02.2013 01:49) большое сродство к 2-цеп.днк. Пока точно не известно с какой именно областью белка связывается днк. зачем чистить?- чтобы проверить насколько днк все-таки влияет на сам белок и на его степень олигомеризации ( да и вообще для чего она ферменту нужна) ну и ради этого морочится - хост-то известен |
abdula Постоянный участник |
(менделеев05 @ 12.02.2013 01:49) большое сродство к 2-цеп.днк. Пока точно не известно с какой именно областью белка связывается днк. зачем чистить?- чтобы проверить насколько днк все-таки влияет на сам белок и на его степень олигомеризации ( да и вообще для чего она ферменту нужна) отфигачил днказой - плюнул-дунул итак сойдет - русский перфекционизм доведет до цугундера |
abdula Постоянный участник |
(менделеев05 @ 12.02.2013 01:49) большое сродство к 2-цеп.днк. Пока точно не известно с какой именно областью белка связывается днк. зачем чистить?- чтобы проверить насколько днк все-таки влияет на сам белок и на его степень олигомеризации ( да и вообще для чего она ферменту нужна) 0.5 м солйю смывается все - никаких контактов с днк |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Присоединяюсь. Интересно как вы определяете ДНК в белке? |
Tom1 Постоянный участник |
2. "сомения его не обманули", походу " менделеевский " делает работу типа ндцатые в мире, но вторые в сибири.... Даже не лазия по пубмеду просто набрав в гоогле имеем массу материалов..... 3. Итого матчасть знать надо.... |
abdula Постоянный участник |
(Tom1 @ 12.02.2013 18:38) ну и чего я тебе говорил - 0.5м сол смывает эту протеазу нхафиг томыч - я не видел белкофф которые держутси на таком мотифе похоже лажа - нужно перегнать солекс-сек |
gostya Постоянный участник |
|
abdula Постоянный участник |
(gostya @ 13.02.2013 18:40) ну и чиго ? |
gostya Постоянный участник |
|
abdula Постоянный участник |
(gostya @ 14.02.2013 05:13) что транслит лен кликнут ? |
Guest IP-штамп: frltbIKmJu36Q гость |
Могу посоветовать старый и неплохой метод о котором все часто забывают - это высаливание. К лизату добавить NaCl до конечной концетрации 2 М. Оставить на +4 на сутки-двое. После этого центрифугируете, в осадке - белок, в супернатанте - идеально чистый раствор ДНК. Ну а дальше осадок растворяйте и отделяйте от белковых примесей. Еще могу посоветовать анионообменную хроматографию, например на DEAE или Q-сефарозу. Белок скорее всего смоеться 0.2-0.5 солью. ДНК смываеться 1-2 М солью и щелочью. Многое еще звисит от длины ДНК фрагментов, геномная ДНК намертво сядет на сорбент, тогда как фрагменты в 100 п.н. могут смыться и 0.5 М солью. |
-Ъ- Постоянный участник Москва |
Сообщение было отредактировано -Ъ- - 19.02.2013 09:53 |
abdula Постоянный участник |
(менделеев05 @ 10.02.2013 03:22) проблема следующая : нужно отделить ДНК от белка ( фермента). Белок ( фермент) - ДНК-связывающий. Есть какие-либо методы ? после 0.5 м соли я не видел белкофф , которые сидят на ДНК |
guest: Алексей IP-штамп: frrC9jm5QSAo6 гость |
(Guest @ 18.02.2013 18:42) Сам намучался очень сильно, пытаясь получить ДНК чистую от белков. Поскольку ДНК нужно очень много (около 100 г за раз), то обычный фенольно-хлороформный метод не подходит, поэтому пришлось опробовать разные подходы. Могу посоветовать старый и неплохой метод о котором все часто забывают - это высаливание. К лизату добавить NaCl до конечной концетрации 2 М. Оставить на +4 на сутки-двое. После этого центрифугируете, в осадке - белок, в супернатанте - идеально чистый раствор ДНК. Ну а дальше осадок растворяйте и отделяйте от белковых примесей. Еще могу посоветовать анионообменную хроматографию, например на DEAE или Q-сефарозу. Белок скорее всего смоеться 0.2-0.5 солью. ДНК смываеться 1-2 М солью и щелочью. Многое еще звисит от длины ДНК фрагментов, геномная ДНК намертво сядет на сорбент, тогда как фрагменты в 100 п.н. могут смыться и 0.5 М солью. В больших объемах данная методика эффективна? |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |