molbiol.ru -> Форезинг дистрофина (аж целых 427кДа) с последующим блотингом!

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* Форезинг дистрофина (аж целых 427кДа) с последующим блотингом!

Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

страницы (2): 1 2 >

Creck
Участник

13.10.2016 01:03

URL #1

Всем доброго времени суток!
Ребята, может кто сталкивался с подобной проблемой...
Нужно отфорезить и отблотить очень тяжелый белок, а именно дистрофин с массой 427 кДа.
Что я делаю:
Пробы выделяю при помощи буфера Tris + SDS + меркаптоэтанол/укс.кис-та
Форез делаю в 6%-ом полиакриламидном геле. Пробовал гнать форез разные промежутки времени, но зафиксировать наличие дистрофина при помощи антител на блоте не удается.

Буду рад совету. Спасибо!

Panaev
Постоянный участник

13.10.2016 05:11

URL #2

А сколько его у вас там ожидается?

MMM
Постоянный участник

13.10.2016 07:32

URL #3

1)Гель 4% и побольше биса 2) Гель длиииинный.
3)А в доте антитела работают с такой пробой? 4) гнать гель после выхода фронта особого смысла нет - это не ДНК. 5 ) Че за уксус в пробе? Какой рН? 6) Форез по Лэмли?

Сообщение было отредактировано MMM - 13.10.2016 07:34

Esya
Постоянный участник
PA, USA

13.10.2016 15:23

URL #4

кстати, да, про дот... а может вам не упираться с форезом, а сделать дот, с правильными контролями - ничуть не хуже, обсчитывать даже удобнее

ksm
Постоянный участник

13.10.2016 15:47

URL #5

а протеазой какой-нибудь его нельзя расщепить? чтобы размеры уменьшить?

Veshka
Постоянный участник
Москва

16.10.2016 02:16

URL #6

3–8% Criterion™ XT Tris-Acetate.

Creck
Участник

17.10.2016 13:20

URL #7

Всем привет! Извините, что пропал надолго из своей же темы.
Постараюсь рассказать все по порядку.
1) сколько у меня ожидается дистрофина я не знаю (и еще у меня негде померить к-во белка в пробе)
2) в лоте АТ вроде бы работают. Уксус производства Panreac (если вы, МММ, это имели в виду). Форез стандартный, по Лэмли, все рН соответствующие.
3) на счет протеазы не знаю, но спасибо за идею, поговорю с начальством
4) Veshka, извиняюсь за тупую просьбу, объясните пожалуйста поподробнее, что вы имеете в виду.

Еще нашел вот на просторах пабмеда, в принципе я все делаю так же, только пробы готовлю менее хитрым способом (я делаю пробы просто на трис буфере с укс. к-той или с меркаптоэтанолом)

Expression analysis of dystrophin protein

Western blot

Protein extracts were isolated from cell cultures using 150 µl of lysis buffer (20mM Tris–HCl pH 6.8, 0.1% SDS, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoxycholic acid, 1mM NaF, 0.1 mM sodium orthovanadate, 2 mM PMSF, protease inhibitors), at 3 days post-differentiation. Protein concentration was determined with the Bradford method. Aliquots corresponding to 20 μg (myoblasts derived from a control muscle, WT) and 60 μg (MyoD-transformed USCs) of proteins were loaded on a 6% polyacrylamide gel and separated by electrophoresis. Samples were transferred to a nitrocellulose membrane that was blocked with non-fat dried milk for 60 min at room temperature and incubated overnight at 4°C with Dys2 antibodies (1:50, Leica). Horse-radish peroxidase conjugated anti mouse secondary antibody (1:1000, Amersham) was used as the secondary antibody. Western blots were developed using ECL Plus Western Blotting Detection System (Amersham).
Ссылка ===> [Falzarano, M. S., D’Amario, D., Siracusano, A., Massetti, M., Amodeo, A., La Neve, F., … Ferlini, A. (2016). DMD myogenic cells from urine-derived stem cells recapitulate the dystrophin genotype and phenotype. Human Gene Therapy, 1–33. https://doi.org/10.1089/hum.2016.079].

Veshka
Постоянный участник
Москва

17.10.2016 16:45

URL #8

http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr.../MS4110130B.pdf Это градиентный гель с некими свойствами. На таких гелях гоняют большие белки. В принципе, не так и сложно сделать самому. Можно и на агарозе, но это немного tricky.

Сообщение было отредактировано Veshka - 17.10.2016 16:48

MMM
Постоянный участник

17.10.2016 17:28

URL #9

--Уксус производства Panreac (если вы, МММ, это имели в виду). Форез стандартный, по Лэмли, все рН соответствующие.

Нет! Имелось ввиду: зачем вы используете трис-ацетатный буфер в пробе?

Сколько времени и в каких условиях вы переносите белок на мембрану? Имеется ввиду тип камеры для переноса? Состав Буфера для переноса? Ток и напряжение при переносе?

Creck
Участник

18.10.2016 13:58

URL #10

Пробы я готовил и с уксусом и без, если точнее, то:
1) с уксусом
2) с меркаптоэтанолом
3) с уксусом и меркаптоэтанолом
И картинки разделяемых белков получались на каждом буфере разные (прилагаю фотки геля, крашенного кумаси, пробы сделаны из мышцы мышки)

Буфер для проб готовил так:
На 20 мл буфера
2 мл трис буфера рН 6.8
5 мл 10% SDS
2 мл глицерина
10 мг бромфенолового

В этот буфер кидал мримерно 1 кубический миллиметр мышцы и грел в термостате на 95 градусах по Цельсию 30-40 мин.

Форез провожу на 120 В, время 1,5 часа - 2 часа 20 мин (пробовал разные промежутки в этом диапазоне)

Камера для переноса amershem - прилагаю фотку сней
Блот делаю полусухой на 100 А и 100 В, время 1,5 - 2 ч 20 мин (тоже пробовал разные варианты). Прилагаю фотку блотницы на всякий пожарный :-)

Блот у меня проходит, возможно, не очень хорошо (прилагаю фотку мембраны ПВДФ после блота, покрашенную кумаси. Пробы те же, что на фотках геля, более тяжелые белки на мембране не окрасились)

Сообщение было отредактировано Creck - 18.10.2016 14:00

Картинки:

180820161365.jpg — (183.7к)

180820161364.jpg — (200.79к)

240620161345.jpg — (184.82к)

080920161376.jpg — (160.86к)

181020161403.jpg — (336.24к)

MMM
Постоянный участник

18.10.2016 14:47

URL #11

Creck! Что у вас за сумбур в голове? Вы всегда отвечаете НЕ то, о ЧЕМ спрашивают?

Я вас не спрашивал о том кладете ли вы уксус в пробу или нет. Я вас спрашивал: ЗАЧЕМ вы это делаете? Он что улучшает выход дистрофина в раствор? Или увеличивает его подвижность?

На вопрос: СОСТАВ БУФЕРА ДЛЯ ПЕРЕНОСА? вообще не ответили.

Что я вижу на ваших картинках. 1) Похоже вы не откручиваете пробы перед нанесением на гель. 2) У вас плохой перенос. 3)На форезе актин и миозин видны, но пробег по миозину, да и по актину не очень, т.е. процентность геля великовата.

Creck
Участник

18.10.2016 15:52

URL #12

МММ, извините, сейчас уточню.
Уксус я клал следуя одному из протоколов, найденных на просторах интернета (зачем он там нужен, точно не знаю, но мне казалось что для улучшения выхода белков в раствор)

Буфер бля переноса:
на 1 литр TS буфера я кладу:
1) Tris-base 5,8 г.
2) Глицин 2,9 г.
3) SDS 10% 3,85 мл
4) Этанол 200 мл (конечная концентрация 20%)

Пробы действительно перед нанесением не откручиваю, более того, я их пепетирую.
На счет процентности геля вы правы, конкретно этот гель (который на фотках в предидущем моем посте) был 20%-ым.
Позже я делал и 5% гель (прилагаю фотку и извиняюсь за ее качество), но также безуспешно.

Картинки:

280920161396.jpg — (209.04к)

Serpent
Постоянный участник
RU-->IT

18.10.2016 17:12

URL #13

2 Creck:
Почему вы решили, что ваш белок вообще экстрагируется из мышцы в Лэммли буфере?
Как вы экстрагировали сей белок для Дот-блота? Покажите картинку результата.
ИМХО мышцу надо гомогенизировать, для начала.

MMM
Постоянный участник

18.10.2016 17:22

URL #14

Ага! Диагноз поставлен.
1) Уберите этанол из буфера для переноса. Да и концентрацию триса в нем можно снизить раза в три, ну в два так точно. Классическая пропись 3 г триса 14,4г глицина.
2)Гель процентность 4-5%, как я уже писал, можно увеличить процент биса в несколько раз.
3)Переносить лучше не в полусухой, а в мокрой камере и подольше(часа 4 -8). Если мокрой камеры нет, то переносить в полусухой подольше, периодически орошая сэндвич свежим буфером.

Поблагодарили (1): Creck

Creck
Участник

18.10.2016 17:26

URL #15

Экстрагирование целевого белка я пока не доказал.
Прилагаю картинку дот блота (на мембрану капал точно такую же пробу, которые гонял на форезе).
И у меня есть подозрение, что на доте у меня может быть неспециффическое связывание.

Подскажите пожалуйста способы гомогенизации мышцы.

Картинки:

010920161374.jpg — (172.6к)

Creck
Участник

18.10.2016 17:30

URL #16

МММ, благодарю! На днях расскажу что в итоге получилось)

Serpent
Постоянный участник
RU-->IT

18.10.2016 17:59

URL #17

(Creck @ 18.10.2016 15:26)

Как именно вы детектируете связывание антител с вашим белком?
В плане гомогенизации, я бы измельчил мышцу любым доступным способом и дальше выделял бы в буфере с детергентом, хотя бы с 1% тритона. Плюс ингибиторы протеаз туда же.
Наверняка кто-то уже выделял ваш белок из мышц, так что попробуйте найти подробную методику в литературе.

MMM
Постоянный участник

18.10.2016 18:47

URL #18

--Пробы действительно перед нанесением не откручиваю, более того, я их пепетирую.
Это зря! Выход белка это не повышает, а грязи на форезе добавляет.

--И у меня есть подозрение, что на доте у меня может быть неспециффическое связывание.
Может и так, для этого надо было хотя бы покрасить дот вторичным коньюгатом, пропуская этап покраски первыми антителами.

--Подскажите пожалуйста способы гомогенизации мышцы.
Ну, можно взять лезвие бритвы и покромсать на мелкие кусочки. Можно заморозить и раздолбить ледышку чем нибудь твердым на чем нибудь твердом. Можно залить кусочек экстрагирующим раствором в эппендорфе и воспользоваться вот таким приборчиком.
user posted image

--Как именно вы детектируете связывание антител с вашим белком?
Ну, судя по картинке используется вторичный коньюгат с пероксидазой и реакция с диаминобензидином

Сообщение было отредактировано MMM - 18.10.2016 19:25

Creck
Участник

19.10.2016 13:15

URL #19

МММ, а на форуме молбиола пропись приготовления трансфер буфера именно такая как я делал http://molbiol.ru/protocol/17_08.html#s2

Creck
Участник

19.10.2016 13:19

URL #20

Вторичку с пероксидазой поливаю диаминбензидином, все верно.
Вопрос в тему - если я добавил перекись в раствор диаминбензидина и он у меня так и хранится на 4+. Это плохо? Или добавлять перекись нужно строго перед применением?

Creck
Участник

19.10.2016 13:22

URL #21

На всякий случай еще хочу отметить, ПВДФ мембрану смачиваю спиртом перед запуском блота

MMM
Постоянный участник

19.10.2016 13:31

URL #22

--МММ, а на форуме молбиола пропись приготовления трансфер буфера именно такая как я делал
Ну и что? Не все что написано в протоколах молбиол'а безусловно хорошо!

--Вопрос в тему - если я добавил перекись в раствор диаминбензидина и он у меня так и хранится на 4+. Это плохо? Или добавлять перекись нужно строго перед применением?

Да, плохо. Будет чернеть при хранении, ДАБ чернеет в водных растворах при хранении и без перекиси, особенно если вода содержит примеси ионов железа, меди, марганца, никеля.

Serpent
Постоянный участник
RU-->IT

19.10.2016 14:06

URL #23

Вот тут все подробно расписано про "форезинг с блоттингом" дистрофина:

Bulman DE1, Murphy EG, Zubrzycka-Gaarn EE, Worton RG, Ray PN.
Differentiation of Duchenne and Becker muscular dystrophy phenotypes with amino- and carboxy-terminal antisera specific for dystrophin.
Am J Hum Genet. 1991 Feb;48(2):295-304.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/P...g00086-0122.pdf

Creck
Участник

19.10.2016 14:18

URL #24

Понял на счет диамина.
Вопрос на счет полиакриламида. В нектороых протоколах пишут, что можно готовить 30% АА (60 г акриламида и 1.6 г биса на 200 мл воды) гель и потом из него бодяжить нужную процентность.
А в некоторых протоколах пишут, что нельзя одновременно понижать или повышать концентрацию акриламида и биса ( что в общем то и происходит, если бодяжить уже приготовленный 30%ый раствор).
Собственно где истина?))
Спасибо!

MMM
Постоянный участник

19.10.2016 15:01

URL #25

--А в некоторых протоколах пишут, что нельзя одновременно понижать или повышать концентрацию акриламида и биса ( что в общем то и происходит, если бодяжить уже приготовленный 30%ый раствор

Вас этот вопрос интересует в отношении конкретно вашего случая или вообще в принципе для ПААГ форезов?

Creck
Участник

19.10.2016 15:15

URL #26

Интересно и вообще, и в данном случае применительно к тяжелому белку.

MMM
Постоянный участник

19.10.2016 16:08

URL #27

Для случая "вообще" - это надо лекцию читать. В вашем конкретном случае, как я уже писал выше можно существенно повысить концентрацию биса в гелях с низкой концентрацией акриламида (3-5%) при этом вы делаете гель механически прочнее, а поры, как не парадоксально не уменьшаются, а увеличиваются. Почему? Это надо небольшую лекцию читать. Да! И гель при этом становится не прозрачным, а мутным, но это нормально.

Creck
Участник

19.10.2016 16:31

URL #28

Круто. А в каких пределах увеличить дозу биса?? Я кладу на 60 г акриламида 1.6 г биса (это 30%, и из него я бодяжу 5%ый). Нормально ли будет положить например 2.6 г биса, или нужно покруче увеличить дозу?

Сообщение было отредактировано Creck - 19.10.2016 17:17

MMM
Постоянный участник

19.10.2016 19:41

URL #29

на 60гакриламида, 5-6г биса. Да и сначала растворять акриламид, а потом бис иначе бис может не раствориться

Creck
Участник

20.10.2016 00:10

URL #30

Понял. А насколько важно добавлять в буфер для проб ингибиторы протеаз?

MMM
Постоянный участник

20.10.2016 06:25

URL #31

(Creck @ 20.10.2016 01:10)

Понял. А насколько важно добавлять в буфер для проб ингибиторы протеаз?

Это полезно если вы собираетесь их долго хранить.

Panaev
Постоянный участник

20.10.2016 06:47

URL #32

(Creck @ 20.10.2016 01:10)

Понял. А насколько важно добавлять в буфер для проб ингибиторы протеаз?

В загрузочный буфер? Так все равно кипятите, зачем ингибиторы?

yack
moderator
Москва, Россия

20.10.2016 10:09

URL #33

MMM, прочтите лекцию
Я серьезно.
Я гонял и переносил титин в 1-2% АА на агарозе. Но до Вашвей идее мы не дошли

Creck
Участник

20.10.2016 12:45

URL #34

(Panaev @ 20.10.2016 07:47)

В загрузочный буфер? Так все равно кипятите, зачем ингибиторы?

Тоже думал над этим. Т.е. ингибиторы протеаз добавляются в пробу, которая должна долго храниться и из которой берется понемножку на форез?

MMM
Постоянный участник

20.10.2016 13:39

URL #35

Ингибиторы лучше добавлять в остывшую пробу, из которой только что взяли на форез аликвоту и закладывают на хранение в морозилку. А добавлять их надо, потому что некоторые протеазы при кипячении в SDS инактивируются обратимо или частично. Конечно протеаз таких мало и активность у них не высокая, поэтому если проба хранится месяц другой замороженной при -20, то особой необходимости в этом нет.

MMM
Постоянный участник

20.10.2016 15:16

URL #36

(yack @ 20.10.2016 11:09)

MMM, прочтите лекцию
Я серьезно.
Я гонял и переносил титин в 1-2% АА на агарозе. Но до Вашвей идее мы не дошли

Все мы привыкли видеть вот такую структуру полиакриламидного геля.

Картинки:
картинка: AA_Bis_Gel_Structure.JPG

AA_Bis_Gel_Structure.JPG — (19.34к)

MMM
Постоянный участник

20.10.2016 15:25

URL #37

Из такой картинки понятно, что чем выше концентрация сшивки бисакриламида, тем меньше образующиеся в геле поры.
Однако! Если мы посмотрим на экспериментальную зависимость радиуса пор, то выяснится, что с ростом концентрации бисАА, радиус пор отнюдь не убывает монотонно, а имеет один глобальный минимум, особенно в условиях, когда концентрация самого акриламида не высока.

Звиняюсь за не очень читаемую картинку.

Сообщение было отредактировано MMM - 20.10.2016 15:42

Картинки:
картинка: AApore_conc_curves.JPG

AApore_conc_curves.JPG — (22.44к)

Поблагодарили (3): ksm, Alex2006, kblag

MMM
Постоянный участник

20.10.2016 15:33

URL #38

Это явление можно довольно просто объяснить тем, что с ростом концентрации БисАА и снижением концентрации АА. Во время полимеризации БисАА с меньшей вероятностью встраивается в соседние цепи АА и с большей вероятностью встраивается в цепи, которые он образует сам с собой. Таким образом сшивки между цепями акриламида становятся состоящими не из одной молекулы БисАА, а из двух и более, что и приводит в конечном итоге к наблюдаемому увеличению среднего радиуса пор.

Из экспериментальной картинки можно заметить, что глобальный минимум обеспечивается концентрацией бисАА примерно в 3-5% от количества АА(или смеси мономеров). Классическое соотношение 30/1(29,2/0,8) часто используемое для заливки Лэмли гелей как раз дает цифру около 3%, что обеспечивает близкий к минимуму средний радиус пор в широком диапазоне концентраций АА в гелях.

Сообщение было отредактировано MMM - 20.10.2016 15:39

Поблагодарили (3): vb, Alex2006, forrest

Creck
Участник

21.10.2016 12:18

URL #39

Добрый день!
Сделал форез на 5%-ом геле с количеством биса большим в 3 с лишним раза.
В результате вообще не получил четких ровных полосок. Понятно, что все белки "разумных" размеров проскочили вниз, но дистрофинчик мой похоже опять не дал себя обнаружить.

Картинки:

211020161406.jpg — (230.94к)

211020161410.jpg — (253.31к)

211020161407.jpg — (251.87к)

Creck
Участник

21.10.2016 18:21

URL #40

Вобще, если присмотреться, то что-то там всеже есть, только полоски размытые, но они есть во всех пробах на одном уровне. На фотках этих ужасных этого конечно не видно.

MMM
Постоянный участник

21.10.2016 18:58

URL #41

Что-то вы не то делаете: то ли электродный буфер не тот, то ли трис тухлый, то ли рН напутали. Ну и не выгоняйте вы фронт.....

Creck
Участник

22.10.2016 01:32

URL #42

так более легкие белки на 20% ом геле нормально обнаруживаются на этих же растворах и буферах

Creck
Участник

22.10.2016 01:33

URL #43

Попробую раздобыть тяжелый маркер и с ним прогнать, посмотрю как маркер бежать будет

Creck
Участник

24.10.2016 13:46

URL #44

Нда, нашел у себя ошибочку. Готовил стоковые растворы по одним протоколам, а смешивал гели по другим протоколам и похоже не все молярности/концентрации учел.

Creck
Участник

25.10.2016 13:02

URL #45

Вобщем толи я гель грамотнее приготовил толи исключение спирта из буфера для блота помогло. Но что-то в итоге вразумительное по-моему получилось.
Мембрану покрасил кмаси и отмыл спиртом 96%-ым.

Сообщение было отредактировано Creck - 25.10.2016 13:03

Картинки:

251020161414.jpg — (208.54к)

MMM
Постоянный участник

25.10.2016 13:08

URL #46

Мои поздравления!

Creck
Участник

25.10.2016 14:19

URL #47

Спасибо!
МММ, прокомментируйте пожалуйста вот что:
В инструкции к диаминобензидину написано, что на 15 мл буфера, в котором разбавляется 1 таблетка диаминобензидина, нужно капнуть 12 мкл ра-ра перекиси 30%-го.
Проблема в том, что когда я готовлю 30% раствор, то перекись в такой большой концентрации очень плохо растворяется и вскоре после растворения выпадает в осадок, причем судя по объему осадка - она вся в него выпадает. Использую таблетированную перекись из аптеки.

ksm
Постоянный участник

25.10.2016 15:43

URL #48

извините, но пероксид водорода - жидкость. возмите 3% и лейте 120 мкл. а вы судя по всему гидропирит берете - там мочевины куча, поэтому и не растворяется. + неизвестно как на реакцию повлияет..

Сообщение было отредактировано ksm - 25.10.2016 15:49

Поблагодарили (1): Creck

MMM
Постоянный участник

25.10.2016 16:39

URL #49

В аптеке в таблетках продается не чистая перекись водорода, а ее аддукт с мочевиной.
В самой таблетке содержание перекиси около 35%
http://www.rlsnet.ru/mnn_index_id_2181.htm...heviny-peroksid
Так что вы в принципе не можете получить из него 30% раствор перекиси водорода. Не смотря на хорошую растворимость мочевины(порядка 50%) в таком маленьком количестве воды она не растворится. Можете получить как говорилось выше 10% раствор и вносить в 3 раза больше чем рекомендует протокол для 30% раствора.

30 % водный раствор пероксида водорода, стабилизированный добавлением фосфатов натрия, называется пергидролем.
https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9F%D0%B5%...%BE%D0%B4%D0%B0

Поблагодарили (1): Creck

Creck
Участник

25.10.2016 17:03

URL #50

Именно так, я растворял в воде гидроперит. БОЛЬШОЕ вам человеческое спасибо)

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.