Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
AmeliRain |
Цель эксперимента определить локализацию белка. Кто работал с пропидиум йодидом, сколько добавлять на покровное стекло с клетками для проверки целостности мембраны и на каком этапе? Сразу после фиксации, после обработки первичными антителами или после обработки вторичными антителами? Может есть ссылки на методические статьи. Заранее благодарю за помощь |
ship Постоянный участник Moscow |
чем фиксировать будете? метанол дырявит мембрану и так. а если ПФА - то обычно еще пермеабилизуют мембрану детергентом чтобы антитела лучше проходили в клетки. в чем смысл проверки целостности мембраны в вашем случае?
|
AmeliRain |
(ship @ 12.07.2018 19:07) на мой взгляд абсолютно бессмысленное занятие определять целостность мембраны у мертвых фиксированных клеток. более того, это никаким образом не имеет отношения к цели вашего эксперимента. чем фиксировать будете? метанол дырявит мембрану и так. а если ПФА - то обычно еще пермеабилизуют мембрану детергентом чтобы антитела лучше проходили в клетки. в чем смысл проверки целостности мембраны в вашем случае? домены белка располагаются внутри и снаружи мембраны. Пермеабилизация с помощью тритона, возможно, что один из доменов белка располагается в цитоплазме и в условиях без тритона сигнала гораздо меньше,но он все же есть и поэтому нужен контроль целостности клетки, так как нам в этом случае дырки не нужны. Фиксируем параформальдегидом. То есть нам не нужно чтобы антитела попадали внутрь в условиях без тритона, но они могли попасть , для этого и нужен контроль целостности клетки, чтобы уже точно определить локализацию доменов белка на мембране. Для контроля расположения клеток дапи, он спокойно проходит и в целые и в повреждённые клетки Сообщение было отредактировано AmeliRain - 12.07.2018 23:02 |
MMM Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
|
MMM Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано MMM - 13.07.2018 13:57
|
ship Постоянный участник Moscow |
|
AmeliRain |
(ship @ 13.07.2018 14:41) а чем иммунизировали типа неизвестно? сомневаюсь что прям полноразмерным рекомбинантным белком, так как если он трансмембранный то получить его в чистом виде в количествах нужных для иммунизации кролика та еще задача Антитела к различным эпитопам. Структура белка ещё не описана, есть только биоинформатическая модель |
AmeliRain |
(ship @ 13.07.2018 14:41) а чем иммунизировали типа неизвестно? сомневаюсь что прям полноразмерным рекомбинантным белком, так как если он трансмембранный то получить его в чистом виде в количествах нужных для иммунизации кролика та еще задача Первичная структура полностью расшифрована* изучаем только пространственную. Конечно известно чем иммунизировали |
ship Постоянный участник Moscow |
мне кажется вам скорее надо на проточник и красить флуоресцентно меченными антителами. пометить можно самим. клетки не фиксируются. покрасилось - эпитоп на поверхности клетки, не красится или слабо - эпитоп в цитоплазме или мембране. и потом у вас просто клетки на покровном стекле то при иммунофлуоресценции сложно будет различить сигнал с поверхности и из цитоплазмы. если вы конечно не делате какие Super resolution microscopy
|
AmeliRain |
(ship @ 13.07.2018 18:18) то есть знаете что иммунизировали на определенный эпитоп, но не знаете где он находится? мне кажется вам скорее надо на проточник и красить флуоресцентно меченными антителами. пометить можно самим. клетки не фиксируются. покрасилось - эпитоп на поверхности клетки, не красится или слабо - эпитоп в цитоплазме или мембране. и потом у вас просто клетки на покровном стекле то при иммунофлуоресценции сложно будет различить сигнал с поверхности и из цитоплазмы. если вы конечно не делате какие Super resolution microscopy Спасибо) |
MMM Постоянный участник |
|
AmeliRain |
(MMM @ 13.07.2018 19:58) Так все что покрасилось АТ в таких непрокрашенных PI клетках, то должно быть снаружи. Ибо туда куда не прошел PI, АТ и подавно не пройдут. А на протоке это делать или на слайде это вопрос затрат труда, времени и наличия оборудования. Да именно так, осталось только продумать схему эксперимента и найти побольше информации про него. Проточная цитометрия может быть уже последующим этапом |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |