Rambler's Top100
Лёгкая версия форума* Виртуальная клавиатура  English  
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы
Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Междисциплинарный биологический онлайн-журналZbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ


Темы за 24 часа  [ Вход* | Регистрация* ]  
   



Форум: 
 

Результаты поиска -- Найденные сообщения --

страницы (16):  1 2 3 > » 

Димеры праймеров
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 06.06.2021 16:57  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1991385  |  Ответов: 5  |  Просмотров: 3 192
Какая концентрация праймеров в реакции? Указанные вами мкл делу не помогают, так как непонятно, какая у вас концентрация стока праймеров.
Снизьте до 150-200 nM.
И зачем так долго держать реакцию на элонгации?

Помогите пожалуйста с выбором спектрофотометра!
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 30.03.2021 18:10  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1956531  |  Ответов: 8  |  Просмотров: 1 575
Qubit нормально работает. И есть у многих, т.е. не будет проблем с закупкой реактивов.

Как можно узнать есть ли ДНК в образце после выделения
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 24.01.2021 15:02  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1919237  |  Ответов: 39  |  Просмотров: 2 090
(DimVik @ 19.01.2021 13:27)
Ссылка на исходное сообщение  Идея хорошая и напрашивается сама собой. Но к сожалению под электрофорез нужна отдельная комната. Ее пока нет. Грязноватый процесс.

Если гонять на форезе выделенную геномную ДНК КРС, то риски минимальные. Это же не ампликоны или плазмиды.

Как можно узнать есть ли ДНК в образце после выделения
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 24.01.2021 14:55  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1919236  |  Ответов: 39  |  Просмотров: 2 090
(Ash @ 18.01.2021 14:45)
Ссылка на исходное сообщение  Главное, в таком случае, чтобы не законтаминировали человеческими образцами....

Точно.
Если консервативные последовательности, то лучше все-таки митохондриальные, IMHO.
Есть небольшой опыт с праймерами на хромосомные консервативные рибосомные повторы, которые тянут всё - от птицы до человека. С ними всё время лезет сигнал в контроле выделения. Видимо, контаминированы наборы для выделения ДНК. С митохондриальными такого нет.

Нужен ультразвуковой дезынтегратор Covaris M220
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 30.10.2020 13:07  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1885735  |  Ответов: 10  |  Просмотров: 2 535
В ИОГене в лаборатории Рогаева был Covaris.

ДНК редактор - YBI ДНК компаньон
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 23.06.2020 10:05  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1830143  |  Ответов: 3  |  Просмотров: 1 503
Мило...но немного напомнило 90-е.
Сделайте, если сможете, чтение хроматограмм сенгеровского секвенирования с выравниванием против референсной последовательности. Такая опция есть в Ugene, Snapgene, benchling, Genome Compiler, но, возможно, будет востребовано, как отдельная программа. Chromas ведь, к примеру, до сих пор используется в хвост и гриву.
И делайте на английском, аудитория будет пошире.

Updated BLAST rRNA Databases: RefSeq Ribosomal RNA Sequences for Identification of Fungi, Bacteria, and Arhaea
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 16.06.2020 09:14  |  Колонка новостейКолонка новостей  |  link: #1828578  |  Ответов: 0  |  Просмотров: 0
Вебинар NCBI
"Updated BLAST rRNA Databases: RefSeq Ribosomal RNA Sequences for Identification of Fungi, Bacteria, and Archaea"
Wed, Jun 17, 2020 7:00 PM - 7:45 PM MSK.
NCBI produces a set of curated marker rRNA sequences (targeted loci) for Bacteria and Archaea (16S) and Fungi (18S, 28S and ITS). We now have 41,000 markers, which are available as a distinct set of BLAST databases. These sequences are largely from type strains and are useful for identifying organisms. You will learn about the scope of the targeted loci projects and see practical examples of using these data and NCBI BLAST to help identify organisms and explore their diversity. You will also learn about and see how to avoid pitfalls of assigning identities only from the BLAST results from a single locus.
https://register.gotowebinar.com/register/3...632048342917133

ПЦР
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 06.06.2020 14:50  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1826084  |  Ответов: 117  |  Просмотров: 8 492
(Vista @ 06.06.2020 14:48)
Ссылка на исходное сообщение  не только в отрицательных контролях, но и не во всех наборах одной серии. день, два, три норм, потом кирдык). Вчера вообще странно, первая хорошо, вторая 90% положительных, третья вообще без положительных (контроли ок) серия одна. вот как так то? между выделениями протирка спиртом, уф.  За день была постановка с высокими I5c  и Ct 16, 18, 20. Я если честно грешу на оператора все же, скорость выделения бешеная, у меня намного дольше получается(, поэтому я редко делаю, нужен вал.

Тогда, похоже, ничего не остается, как осуществлять ротацию персонала на рабочих местах и проводить постоянный анализ (оператор, лот, условия и т.д), который советовали выше.
Какая разница, что Ваш уникальный оператор, как многорукая Шива, выделяет РНК со скоростью робота, если все равно приходится повторять анализы?

ПЦР
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 06.06.2020 13:23  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1826064  |  Ответов: 117  |  Просмотров: 8 492
На последних циклах в пробах что-то поднимается, но не поднимается в отрицательном контроле — это не контаминация, а что-то с дизайном или качеством олигов, смею предположить. Температуру отжига повысить нельзя? СОП не велит?

ПЦР
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 02.06.2020 14:14  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1825033  |  Ответов: 117  |  Просмотров: 8 492
(Asterix @ 02.06.2020 13:59)
Ссылка на исходное сообщение  Фантазеры  однако ..  и каким образом интересно  вы из сухого пятна крови  получите  функциональные антитела?  да еще количественно?  Попытайтесь растворить  сухое пятно крови  без использования  протеиназ  и хаотропов ...

Им там рецензенты  похоже  таких вопросов не задавали  перед публикацией .

Так это же препринт. Можете авторам прямо задать этот вопрос. В качестве самоназначенного рецензента.

ПЦР
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 02.06.2020 11:00  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1824987  |  Ответов: 117  |  Просмотров: 8 492
Продолжу флудить здесь. Простите, уважаемая Виста.
Прикольная комбинация серологического теста и ПЦР для выявления антител к SARS-Cov2.
Позволяет работать с сухими пятнами крови.

"..For the testing, the eluent was assayed using a modified Antibody Detection by Agglutination-PCR (ADAP) protocol [12-14]. Briefly, 8 µL of eluent was incubated with 8 µL of 1 femtomole of SARS-CoV-2 spike protein S1 subunit-DNA conjugate pair mixtures at 37 °C for 30 min. If present, the SARS-CoV-2 antibodies in the specimen engage with S1-DNA conjugate to agglutinate into a dense immune complex. To quantify the degree of agglutination, 116 µL of ligation solution (20 mM Tris, 50 mM KCl, 20 mM MgCl2, 20 mM DTT, 25 μM NAD, 0.025 U/μl ligase, 100 nM connector) was mixed with 4 µL eluent/conjugate mixture and incubated at 30 °C for 15 min. Then, 25 µL of the ligated solution was mixed with PCR master mix that contained primer pairs and polymerase for amplification under standard thermocycling conditions (95 °C for 10 min, 95 °C for 15 sec, 56 °C for 30 sec, 13 cycles). The pre-amplified products were then quantified in a 96-well qPCR plate. SYBR green-based qPCR was performed on a Bio-Rad CFX96 real-time PCR detection system (95 °C for 10 min, 95 °C for 30 sec, 56 °C for 1 min, 40 cycles). As a result of agglutination, specimens harboring high quantities of antibodies will have large quantities of amplifiable DNA, thus exhibiting a strong qPCR signal (low Ct). In contrast, samples without SARS-CoV-2 antibodies
will have few DNA amplicons, thus yielding a weaker qPCR signal (high Ct)
"
https://www.medrxiv.org/content/10.1101/202...6004v1.full.pdf

ПЦР
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 01.06.2020 16:27  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1824871  |  Ответов: 117  |  Просмотров: 8 492
(-Ъ- @ 28.05.2020 15:58)
Ссылка на исходное сообщение  ....
  - убрать ревертирование практически невозможно. Пока температура смеси от комнатной (несколько минут) до 95 доползает (еще минута) ревертаза уже насинтезирует кучу всего. ...

Вот тут пишут, какой состав буфера в реакции должен быть, что Taq-полимераза сревертировала РНК без обратной транскриптазы.
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.05.27.120238v1

ПЦР
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 01.06.2020 12:13  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1824825  |  Ответов: 117  |  Просмотров: 8 492
(-Ъ- @ 01.06.2020 13:06)
Ссылка на исходное сообщение  ...Но самое приятное эти коротенькие транскрипты, меньше 100 нукл. в присутствии  ингибитора РНК-аз хранятся месяцами в холодильнике. ..

В простой морозилке? Или вообще при 4 оС?

ПЦР
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 01.06.2020 11:06  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1824801  |  Ответов: 117  |  Просмотров: 8 492
(vb @ 31.05.2020 21:48)
Ссылка на исходное сообщение  ....
это понятно любому, кто сталкивался с клинической диагностикой, даже не в качестве разработчика...

Не согласна с этим тезисом. Сталкивалась с множеством безграмотных.

Мне любопытна история про положительный контроль для теста на РНКовый вирус.

Судя по тому, что пишет уважаемая Виста про раствор для положительного контроля, в ее лаборатории работают с ДНК в качестве положительного контроля.

Про наборы Вектора пишут, что у них нет внутреннего РНКового контроля.
"...одним из недостатков «векторовского» набора является то, что в нем есть лишь реагенты для ПЦР, то есть третьей, заключительной операции анализа. А для выделения РНК и обратной транскрипции предлагается использовать наборы других производителей. В комплектации набора также отсутствует внутренний контрольный образец (ВКО) — молекула РНК, защищенная от действия нуклеаз, которую добавляют в образец и которая вместе с мишенью проходит все стадии анализа..."
https://pcr.news/stati/test-na-koronavirus-dlya-rossii-2/

ПЦР
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 31.05.2020 16:53  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1824686  |  Ответов: 117  |  Просмотров: 8 492
(-Ъ- @ 31.05.2020 17:31)
Ссылка на исходное сообщение  На самом деле изготовление транскрипта когда есть под рукой нужный ампликон с Т7 промотором совсем просто.  Самое сложное - в каком виде подавать его в качестве (+) контроля в китах umnik.gif

CDC поставляет РНК положительного контроля в лиофизованном виде. После разведения надо сделать аликвоты по 30 мкл, аликвоты заморозить на -70 oC. После размораживания аликвоту используют, её неиспользованные остатки выбрасывают.


...2019-nCoV Positive Control (nCoVPC) Preparation:
1) Precautions: This reagent should be handled with caution in a dedicated nucleic acid handling
area to prevent possible contamination. Freeze-thaw cycles should be avoided. Maintain on ice
when thawed.
2) Resuspend dried reagent in each tube in 1 mL of nuclease-free water to achieve the proper
concentration. Make single use aliquots (approximately 30 μL) and store at ≤ -70oC.
3) Thaw a single aliquot of diluted positive control for each experiment and hold on ice until adding to plate. Discard any unused portion of the aliquot...

ПЦР
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 31.05.2020 12:51  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1824657  |  Ответов: 117  |  Просмотров: 8 492
Смотрю на инструкцию CDC и вижу, что у них положительный контроль - это in vitro транскрибированная РНК. И это правильно. Что служит положительным контролем в отечественных наборах? Меня терзают смутные сомнения, что это ампликон, заклонированный в плазмиду.
...2019-nCoV Positive Control (nCoVPC)
For use as a positive control with the CDC 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel procedure. The nCoVPC contains noninfectious positive control material supplied in a dried state and must be resuspended before use. nCoVPC consists of in vitro transcribed RNA. nCoVPC will yield a positive result with each assay in the 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel including RP. ...
https://www.fda.gov/media/134922/download

ПЦР
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 28.05.2020 16:56  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1824039  |  Ответов: 117  |  Просмотров: 8 492
А в чём у вас выражается контаминация?
Есть продукт в контроле выделения? В отрицательном контроле? В заведомо отрицательных пробах? На каком цикле появляется контаминация?
Просто из любопытства - положительным контролем служит плазмида или всё-таки РНК?

ПЦР
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 27.05.2020 11:18  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1823658  |  Ответов: 117  |  Просмотров: 8 492
Использование носиков с фильтрами - профилактика контаминации, передающейся через дозаторы.

Covid-19(инфо)
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 03.04.2020 11:13  |  БеседаБеседа  |  link: #1809165  |  Ответов: 2201  |  Просмотров: 127 684
(Carbon Copy @ 03.04.2020 02:22)
..... А вот так, когда молекулярная лаба под ударом пандемии перегружена работой приглашать новых сотрудников и затыкать ими дыры своего планирования -....

Справедливости ради надо отметить, что больница в Коммунарке открылась только что и прежде запланированного срока. То есть, они начали работать с колёс.

Covid-19(инфо)
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 02.04.2020 19:14  |  БеседаБеседа  |  link: #1809018  |  Ответов: 2201  |  Просмотров: 127 684
https://vk.com/wall-110012660_323
Денис Проценко, главврач 40-й (просьба расшарить)

«Уважаемые коллеги! Нам в команду требуются врачи и лаборанты для ПЦР-диагностики
Звоните по общему номеру +7 495 744 07 03 или +7 968 921 40 23»

Covid-19(инфо)
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 02.04.2020 07:10  |  БеседаБеседа  |  link: #1808847  |  Ответов: 2201  |  Просмотров: 127 684
(septoplast @ 01.04.2020 22:08)
Ссылка на исходное сообщение  не deltaCt а просто Ct

В статье пишут deltaCt, правда, я не поняла, какой они использовали референс. Какой-то внутренний положительный контроль?

Covid-19(инфо)
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 01.04.2020 20:57  |  БеседаБеседа  |  link: #1808775  |  Ответов: 2201  |  Просмотров: 127 684
(Panaev @ 01.04.2020 16:53)
Ссылка на исходное сообщение  Хм... а я думал, что в клинических испытаниях оценивают диагностическую чувствительность и специфичность. Или так все поменялось за те годы, что я не занимаюсь клинической диагностикой?
Причем тут чувствительность в копиях на мл? Это химическая чувствительность. Диагностическая может вообще с ней не коррелировать.

Это фишка количественного ПЦР.
С клиникой показатели теста могут коррелировать, а именно: малые значения deltaCt обычно свидетельствует о высокой вирусной нагрузке и можно ожидать тяжелое течение болезни (https://www.thelancet.com/journals/laninf/article/PIIS1473-3099(20)30232-2/fulltext).

КСтати, вот свеженькое сравнение разных RT-qPCR тестов, которые используют за рубежом. Авторы работают в Штатах.
Vogels et al. Analytical sensitivity and efficiency comparisons of SARS-COV-2 qRT-PCR assays //MedRxiv. - 2020. - https://doi.org/10.1101/2020.03.30.20048108
https://www.medrxiv.org/content/10.1101/202...3.30.20048108v1

А это от корейцев:
Jung et al. Comparative analysis of primer-probe sets for the laboratory confirmation of SARS-CoV-2//bioRxiv 2020.02.25.964775; doi: https://doi.org/10.1101/2020.02.25.964775
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.25.964775v1

От китайцев:
Xiong et al. Comparative performance of four nucleic acid amplification tests for SARS-CoV-2 virus// bioRxiv 2020. - oi: https://doi.org/10.1101/2020.03.26.010975
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.26.010975v1

Covid-19(инфо)
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 01.04.2020 11:28  |  БеседаБеседа  |  link: #1808643  |  Ответов: 2201  |  Просмотров: 127 684
(Vladimirkox @ 31.03.2020 18:28)
Ссылка на исходное сообщение  Сколько времени нужно для наработки S-белка в фаговом дисплее? А иммунизировать им можно? А торможение сыворотками реконвалесцентов делать можно?
Тут ещё и Ковальчук с синхротронным излучением АГ-детерминанты локализовать может, судя по его обещалкам.
https://www.anews.com/p/126904841-zabolevsh...al-obrashhenie/
Угу, между инфекционистом и реаниматологом - дистанция огромного размера. Кстати, о каком иммунитете он там лепечет?

С вакциной, похоже, какая-то засада. Я совсем не иммунолог, но насколько поняла, что иммунизация антикороновирусными вакцинами сама по себе может вызвать патологические процессы в лёгких.
"These results suggest that an excessive host immune response against the nucleocapsid protein of SARS-CoV is involved in severe pneumonia caused by SARS-CoV infection."

Tseng, C. T., Sbrana, E., Iwata-Yoshikawa, N., Newman, P. C., Garron, T., Atmar, R. L., ... & Couch, R. B. (2012). Immunization with SARS coronavirus vaccines leads to pulmonary immunopathology on challenge with the SARS virus. PloS one, 7(4).
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3335060/

Yasui F. et al. Prior immunization with severe acute respiratory syndrome (SARS)-associated coronavirus (SARS-CoV) nucleocapsid protein causes severe pneumonia in mice infected with SARS-CoV //The Journal of Immunology. – 2008. – Т. 181. – №. 9. – С. 6337-6348.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18941225

Honda-Okubo Y. et al. Severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus vaccines formulated with delta inulin adjuvants provide enhanced protection while ameliorating lung eosinophilic immunopathology //Journal of virology. – 2015. – Т. 89. – №. 6. – С. 2995-3007.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25520500

Covid-19(инфо)
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 29.03.2020 13:16  |  БеседаБеседа  |  link: #1807473  |  Ответов: 2201  |  Просмотров: 127 684
(vb @ 28.03.2020 18:33)
Ссылка на исходное сообщение  медицинская статистика - это такая статистика smile.gif.
не, может унемцев, кстати, она более-менее адекватная.
но зная как это работает в россии и учитывая, что "если вас в россии устраивает все, кроме климата, то вам нужно жить в италии", то итальянская статистика...  confused.gif

В NYT пишут (https://www.nytimes.com/2020/03/28/opinion/germany-coronavirus.html), что немцы вовремя загнали пожилых людей в самоизоляцию, поэтому средний возраст инфицированных в Германии значительно ниже, чем у итальянцев (46 vs 63). И процент пожилых среди заболевших ниже, чем в среднем по популяции.
Плюс санитарные меры: отслеживание контактов заболевших, диагностика среди них и карантин инфицированных.

И снова про коронавирус
semi
Постоянный участник
Москва


Отправлено: 28.03.2020 20:26  |  Молекулярная и клеточная биологияМолекулярная и клеточная биология  |  link: #1807180  |  Ответов: 3  |  Просмотров: 2 571
IMHO, нет. Проветривать смысл имеет.
Пруф: Liu, Y., Ning, Z., Chen, Y., Guo, M., Liu, Y., Gali, N. K., ... & Liu, X. (2020). Aerodynamic Characteristics and RNA Concentration of SARS-CoV-2 Aerosol in Wuhan Hospitals during COVID-19 Outbreak. bioRxiv.
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.03.08.982637v1
страницы (16):  1 2 3 > »  

Новые сообщения  Есть новые сообщения
Нет новых сообщений  Нет новых сообщений
Нет новых сообщений*  Тема с вашим участием
Горячая тема - новые сообщения  Горячая тема (есть новые сообщений)
Горячая тема - нет новых сообщений  Горячая тема (нет новых сообщений)
Важно - нет новых сообщений  Важная тема
Опрос - есть новые голоса  Опрос — есть новые голоса
Опрос - нет новых голосов  Опрос — нет новых голосов
Опрос -нет новых голосов  Опрос с вашим участием
Объявление  Объявление
Тема закрыта  Закрытая тема
Тема перемещена  Перемещённая тема


Rambler   molbiol.ru - методы, информация и программы для молекулярных биологов              

 ·  Викимарт - все интернет-магазины в одном месте  ·  Доска объявлений Board.com.ua  · 
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---

Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Ваш форум  ·  redactor@molbiol.ru  ·  реклама  ·  Дата и время: 16.10.21 04:05
Bridged By IpbWiki: Integration Of Invision Power Board and MediaWiki © GlobalSoft