Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
robox22 |
|
vb Постоянный участник |
еще вместо формальдегида иногда акролеин хорошо себя показывает, но тоже есть ограничения. Сообщение было отредактировано vb - 31.03.2020 23:59
|
vb Постоянный участник |
скорее всего придется в бумажную библиотеку ножками потопать. уж больно у вас методы старинные. |
Bear Постоянный участник Москва |
|
Bear Постоянный участник Москва |
Каральник, Борис Вольфович. Эритроцитарные диагностикумы [Текст]. - Москва : Медицина, 1976. - 162 с. : ил.; 22 см. FB Б 76-4/1260 FB Б 76-4/1261 FB Арх |
Bear Постоянный участник Москва |
Микробиология Хранение: FB 9 98-6/3381-6; Хранение: FB 9 98-6/3382-4; |
Bear Постоянный участник Москва |
|
vb Постоянный участник |
|
Bear Постоянный участник Москва |
|
CowDoc Постоянный участник Middle East |
(vb @ 01.04.2020 11:05) Формалинизированные никаких проблем нет лиофилизировать (для наших определенных диагностических целей). А вот нативные, и чтобы они целенькими остались (тк с рядом вирусов, сразу садится активность, как формалинизируешь). Когда-то тж занимался. Дипломница даже у меня была по этой теме. Посмотрю, что найду. Но уже написали принцыпы. Топикстартер, концентрированный брал ф., + рН/отмывка, вот и проблемы. |
CowDoc Постоянный участник Middle East |
Методика, предполагающая фиксацию и сенситизацию (Без этих этапов процесс лиофилизации будет более простым) Фиксация эритроцитов человека *либо формалином (при комнатной температуре смешать равные объемы 10% клеточной суспензии и 10%–го раствора формалина в PBS. Инкубация 8 часов при 37°С . Далее клетки промывают трижды в дист. воде и 1 раз в физ. растворе. Конечную 20%-ную суспензию клеток в физ. растворе стабилизируют 0,1% азидом и хранят в холодильнике в течении нескольких месяцев; *либо глютаральдегидом (заранее готовим буфер, смешиванием 1-го объема PBS, [0,15М, pH 8,] с 9-ю объемами физ. раствора и 5-ю объемами дист. воды. Этот буфер охлаждаем до +4°С и в нем готовим 1% раствор глютаральдегида. В 1%-ном растворе глютаральдегида создают 1% суспензию клеток, которую инкубируют 30 минут при +4 С. Затем клетки отмывают 5 раз дистиллированной водой, 5 раз – физ. раствором. 20%-ную суспензию клеток в физ.растворе стабилизируют 0,1% азидом и хранят в холодильнике [ ] Тонирование и сенситизация эритроцитов человека используют либо tannic acid, либо chromium chloride. Вариант сенситизации 1. Смешивают равные объемы 2% суспензии фиксированных клеток и раствор tannic acid (1/15 000), выдерживают 40 минут при 37°С. Далее клетки промывают дважды и конечный осадок взвешивают до 2%-ной суспензии в растворе антигена. Раствор антигена готовят на смеси PBS и физ. раствора. Клетки выдерживают 50 минут при 37°С. Далее клетки промывают дважды и используют сразу, либо дополнительно стабилизируют формалином (конц. не указана) для более позднего использования. Вариант сенситизации 2. Эритроциты взвешивают в виде 2% суспензии в растворе антигена. Наиболее оптимальную концентрацию раствора антигена находят в предварительных экспериментах. Время инкубации – до часа при 37°С. Далее на каждый миллилитр суспензии клеток приливают 0,4 миллилитра 0,8%-ного раствора chromium choride Cr Cl3*6H2O на дистиллированной воде. Раствор chromium choride готовят непосредственно перед использованием из 10%-ного стока. Клетки выдерживают с агентом 7-10 минут, после чего промывают дважды физ. раствором. Фиксированные клетки, сенситизированные по обоим вариантам, хранятся при 4°С несколько недель. Для более длительного хранения их лиофилизируют [ii]. Буфера для лиофилизации К 2%-ной суспензии клеток (фиксированных) в растворе антигена сразу после времени, достаточного для сенситизации, приливали равный объем 6%-ного раствора формалина. рН=7,2. Формалин вливаем плавно, медленно перемешивая. Клетки выдерживаем с формалином при 37°С , 3-4 часа. Это делается для дополнительной стабилизации комплекса эритроцит-сенситизатор. Затем клетки отмывают дважды в смеси (½ физ-раствора+1/2 PBS). Конечный осадок ресуспендировали до 6%-ной концентрации в PBS, содержащем 6% сыворотки [ii]. Полученную смесь разливают в ампулы/пенициллинки по 1-3 мл, охлаждаю на сухом льде, погружением в жидкий азот на 30 секунд или в морозильной камере до -70˚С, -80˚С. Если это не возможно, охлаждают в камере лиофилизатора до -40 ˚С со скоростью -1С/мин. Лиофилизация эритроцитов барана Забор крови барана Цельную кровь забирали в бутыль, содержащий раствор Альсевера (20,5 г глюкозы, 0.2 г NaCl, 8 г цитрата натрия, 0.55 г лимонной кислоты на 1 литр дистиллированной воды). Наполнение бутыля с раствором Альсевера проводят до тех пор, пока соотношение объемов кровь : раствор не станет 1:1. Фиксацию эритроцитов проводят обязательно в тот же день [ ]. Эритроциты следует промыть в охлажденном физ. р-ре не менее 5 раз, при скорости вращения центрифуги не более 1000 g. Время осаждения – 15 минут/цикл. Конечный осадок ресуспендировать в PBS до 10-12% концентрации. Фиксация эритроцитов барана (без сенсибилизации) К нативной крови барана, разведенной вдвое раствором Альсевера, либо к 10% суспензии промытых эритроцитов в PBS добавляют: а) равный объем 0,3-0,5% раствора глютеральдегида или б) равный объем 4% раствора формалина в цитрате натрия (0.15 M). Раствор альдегида приливают медленно, плавно перемешивая. Смесь оставляют на ночь при 37°С на шейкере в медленном режиме. Затем клетки промывали 5 раз в PBS при 1000 g в течение 20 минут. [i] Фиксация эритроцитов человека (без сенсибилизации) *либо формалином (при комнатной температуре смешать равные объемы 10% клеточной суспензии и 10%–го раствора формалина в PBS. Инкубация 8 часов при 37°С . Далее клетки промывают трижды в дист. воде и 1 раз в физ. растворе. Конечную 20%-ную суспензию клеток в физ. растворе стабилизируют 0,1% азидом и хранят в холодильнике в течении нескольких месяцев; *либо глютаральдегидом (заранее готовим буфер, смешиванием 1-го объема PBS, [0,15М, pH 8,] с 9-ю объемами физ. раствора и 5-ю объемами дист. воды. Этот буфер охлаждаем до +4°С и в нем готовим 1% раствор глютаральдегида. В 1%-ном растворе глютаральдегида создают 1% суспензию клеток, которую инкубируют 30 минут при +4 С. Затем клетки отмывают 5 раз дистиллированной водой, 5 раз – физ. раствором. 20%-ную суспензию клеток в физ.растворе стабилизируют 0,1% азидом и хранят в холодильнике [ ] ё) Наиболее эффективным методом считают двойную фиксацию эритроцитов глютаральдегидом и сульфосалициловой кислотой: стоковый раствор 25% глютаральдегида обрабатывают активированным углем, разводят до 1% смесью двух объемов PBS и одного объема воды. Эту смесь охлаждают на водяной бане и ею разбавляют отмытые эритроциты барана до формирования 2% суспензии. Экспозиция длится 30 минут при 4°С и периодическом перемешивании. Затем клетки промывают трижды PBS, ресуспендируют в PBS до 10%, вносят поливинилпирролидон до 1% и приливают равный объем 1,5% сульфосалициловой кислоты в PBS, в котором также содержится 1% поливинилпирролидона. Клетки выдерживали 30 минут при комнатной температуре, плавно перемешивая. Затем их отмывают трижды и подвергают сенситизации [ ].
|
CowDoc Постоянный участник Middle East |
|
vb Постоянный участник |
|
vb Постоянный участник |
перспектива их применения в микробиологии//Ж. микробиоло- гии.-1965.-N 2.-С.100. 2.Азаренок К.С. К возможности обнаружения токсина в крови больного ботулизмом при помощи реакции пассивной гемагг- лютинации// Ж. микробиол.-1970.-N 7.-С. 112. 3.Ахметов Н.С. Общая и неорганическая химия.-М.:В.Ш., 1981.-С. 358-359. 4.Барбан П.С. Fab-фрагменты антител как основа антимикробных иммуноглобулиновых препаратов//Автореф. док. дисс.-М.-1980. 5.Барбан П.С. О механизме сенсибилизации эритроцитов белками в связи с пространственными взаимоотношениями иммуногло- булинов и их фрагментов с поверхностью танизированных эритроцитов//Ж. микробиологии.-1980.-N 6.-С.103. 6.Баяр Г.А., Коникова Р.Е., Крылов В.Н. методике постановки реакции непрямой гемаггютинации с эритроцитами, сенсиби- лизированными антителами//Ж. микробиологии.-1966.-N 7.-С. 97. 7.Березкина Г.В., Никитюк Н.М., Филимонова И.Н., Опочинский Э.Ф. Диагностическая эффективность листериозного эритро- цитарного антигенного диагностикума.//ЖМЭИ.-1993.-N 6.-С. 93-94. 8.Вайсман И.Ш. и др.Исследование реакции непрямой гемагглю- тинации на уровне ультраструктур//Ж. микробиоло- гии.-1978.-N 7.-С.136. 9.Гайдамович С.Я., Клиссенко Г.А., Шаноян Н.К. Реакция агг- лютинации сенсибилизированных антителами эритроцитов ви- русом колорадской клещевой лихорадки// Вопр. ви- - 45 - русол.-1974.-N 2.-С. 169. 10.Горисюк А.Ф., Голодюк Л.Ф. Формирование противодифтерий- ного иммунитета при иммунизации кроликов соматическими антигенами дифтерийной палочки// В кн.: Вакцины и сыво- ротки.-Киев, 1973.- вып. 7.-С. 57. 11.Дорошкевич Л.Ц. О модификации метода сенсибилизации эрит- роцитов антителами с помощью солей хрома//В кн.: Вопросы серологической диагностики.-Алма-Ата,1975.-С. 45. 12.Дьяченко Н.С.//Пассивная гемагглютинация и ее применение в вирусологии.-Киев:Наукова думка,1979. 13.Иммунологическая диагностика вирусных инфекций/Под ред. Т.В.Перадзе,П.Халонена.-М.:Медицина,1985.-С. 98-120. 14.Каральник Б.В. Научные основы изготовления эритроцитарных диагностикумов//Ж. микробиологии.-1977.-N 4.-С.29. 15.Каральник Б.В.,Трошина Г.И. О характере сил взаимо- действия эритроцитов и бактериальных сенситинов. Сообще- ние 1//ЖГМЭИ.-1969.-N 2.-С.150. 16.Каральник Б.В. Количественный анализ процесса взаимо- действия эритроцитов и бактериальных антигенов. Сообщение 8//Ж. микробиологии.-1972.-N 9.-С. 77. 17.Каральник Б.В., Царевский Ю.П., Шамардин В.А.//Эритроци- тарные белковые диагностикумы.-Алма-Ата: Наука, 1981. 18.Каральник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы.-М., 1976. 19.Клиссенко Г.Б.,Лаврова Н.А.,Аннун К. и др. Реакция непря- мой гемагглютинации для индикации вируса Западного Нила в крови животных и комарах при экспериментальной инфекции// В кн.:Экология вирусов.-М.,1980.-С. 71-76. 21.Кондрашова З.Н. и др. Реакция непрямой гемагглютинации как группоспецифический тест диагностики некоторых ви- русных заболеваний//В кн.: Вопросы медицинской вирусоло- - 46 - гии.-М., 1975.-С. 156. 22.Коникова Р.Е., Баяр Г.А. К усовершенствованию методики консервирования эритроцитов для реакции непрямой гемагг- лютинации//Лабораторное дело.-1967.-N 4.-С. 242. 23.Коникова Р.Е.,Баяр Г.А. Методика консервирования сенсиби- лизированных эритроцитов для реакции непрямой гемагглюти- нации//Лабораторное дело.-1965.-N 2.-С.73-74. 24.Коникова Р.Е.,Носков Ф.С.,Баяр Г.А. Применение РНГА для выявления вирусов группы клещевого энцефалита//Вопр. ви- русол.-1968.-N 2.-С.159-163. 25.Коникова Р.Е.,Носков Ф.С.,Баяр Г.А. Разработка эритроци- тарных препаратов для выявления антигенов и антител в РНГА//В кн.:Реакция непрямой гемагглютина- ции.-Л.,1981.-С.13-31. 26.Корнеева Э.П.,Прозорова И.Н.,Шварцман Я.С.,Ильенко В.И.Использование РНГА для определения антител к вирусу японского энцефалита//Лабораторное дело.-1975.-N 12.-С.729. 27.Крам Д., Хэммонд Дж. Органическая химия.-М.: Мир, 1967.-С. 319-320. 28.Лакин Г.Ф. Биометрия.-М.:В.Ш.,1980. 29.Леви М.И., Орлова Г.М., Сучков Ю.Г. Серологические иссле- дования при чуме//Труды Азербайдж. противочумной стан- ции.-1962.-т. 3.- С. 281. 31.Лещук С.И. Совершенствование иммунодиагностикума для оп- ределения HBs Ag методом реакции обратной пассивной ге- магглютинации и его клинико-эпидемиологическое испытание в Восточной Сибири. Дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н. Ир- кутск, 1991. 32.Макаров К.А., Кибардин С.А. Иммобилизированные биопрепа- раты в медицине.-М, 1980. - 47 - 33.Меньшов П.И., Шмутер М.Ф. Подбор оптимальных методов фор- малинизации эритроцитов для приготовления стойких эритро- цитарных диагностикумов для чумы и бруцеллеза// Пробл. особо опасн. инф.- 1969.-вып. 6.-С. 231. 34.Образцова Е.М. Антигенные эритроцитарные препараты для обнаружения антител к Yersinia enterocolitica сероваров О:5,О:7,8;О:6,30//Ж. микробиологии эпидемиологии и имму- нобиологии.-1993.-N 6.-С. 91-92. 35.Оловников А.М. Определение содержания антигенов по агглю- тинации эритроцитов, покрытых поликонденсированными тет- раазотатом диаминодифениламина белками антисыворотки// ДАН СССР.-1966.-т. 169.-С. 1180. 37.Полевая О.Ю.,Ковалев И.Е. Принципы синтеза конъюгирован- ных антигенов//Химико-фармацевтический жур- нал.-1978.-т.12.-N 2.-С.8. 38.Полинг Л., Полинг П. Химия : пер. с англ.-М.:"Мир", 1978.-С. 482-483. 39.Радавский Ю.Л., Зайцева Л.С., Кухарь В.П. Бифункциональ- ные поперечносшивающие реагенты и методы получения конъ- югатов пептид-носитель// Биополимеры и клетка.-1993.-т. 9.-N 4.-С. 3-21. 40.Сафронов Б.Н. и др.//Лаб. дело.- 1964.-N 9.-С. 52. 42.Справочник по микробиологическим и вирусологическим мето- дам исследования/ Под ред. М.О. Биргера.-М:"Медици- на",1982. 43.Справочник химика.-М.:ГНТИХЛ, 1963.-т. 2.-С. 417-417. 44.Субботина Ю.Л., Левинсон В.И. Количественное определение - 48 - иммуноглобулинов в реакции торможения гемагглютинации. Сообщение 2. Сравнение с результатами радиальной иммуно- диффузии//ЖМЭИ.-1980.-N 6.-С. 76-81. 45.Сучков Ю.Г.,Канатов Ю.В. Сенсибилизация формалинизирован- ных эритроцитов иммунными гаммаглобулинами//Ж.микробиоло- гии.-1965.- N 8.-С.63. 47.Царевский Ю.П., Каральник Б.В. Молекулярные аспекты взаи- модействия альбумина и танизированных эритроцитов.Сообще- ние 1//Ж. микробиологии.-1975.-N 4.-С.98. 48.Химический энциклопедический словарь.-М.: "Сов. энцикло- педия",1983.-С. 133, 689. 49.Химия и функция белков/Гауровиц Ф.-М.:1965. 50.Черняев Ю.А., Бондаренко Т.В. Сенсибилизация эритроцитов для РПГА с помощью хлористого хрома и методы их консерви- рования.//В кн.: Вопросы ветеринарной вирусологии.-Влади- мир, 1976.-С. 142-143. 52.Эссель А.Е. Реакция непрямой гемагглютинации.-М., 1964. 53.Boyden S.V. The adsorption of proteins on erythrocytes treated with tannic acid and subsequens hemagglutination by antiprotein sera// J. exp. Med.-1951.-v. 93.-p. 107. 54.Edelberg R.G.// Cell. Compar. Phisiol.- 1953.-N 41.- P. 37. 55.Godal T. On the adsorption of thyroglobulin to formalinizid and tannid human erythrocytes// Acta pathol. microbiol. Scand.-1966.-v. 68.-p. 249. 56.Grmlich F., Mohring D., Muller H.E. Quantitative - 49 - Untersuchungen zur Beladbarkeit normaler und vorbehaandelter Kaninchenerythrocyten mit Humanalbumin-I(131) und gammaglobulin-I(131)//Ztscr. Hyg. Infektionskrankh.-1963.-Bd. 149.-s. 187. 57.Kozin F., McCarty D.J. Molecular orientation of immunoglobulin G adsorbed to microcristalline monosodium urate monohydrate//J. lab. clin. Med.-1980.-v. 95.-p. 49. 58.Kumagai R.N., Balducci D. Analisi dei fattori infuenzanti la sensibilita della emoagglutinazione e della inibizione della emoagglutinazione di emazie trattate co acido tannico e coningate con protein// Rend. ist. super. sanit.-1959.-v. 224. -p. 368. 59.Martiner O.V. e.a. Purfication of the extracellular opacity factor of a strain of group A Streptococcus N type 2// J. Gen. Microbiol.-1978.-v. 105.-p. 29. 60.Reddy D.R., Hariprasada R., Padma M.C., Lopal V.R. Haemagglutination test to detect Tobacco Mosaic Virus antigens // Indian J. exp. Biol.-1969.-v. 7.-p. 162. |
robox22 |
|
vb Постоянный участник |
(robox22 @ 02.04.2020 18:41) ты заходи, если что. если бюджет позволяет - лучше нанять человека, делавшего это руками , чтобы самому на все грабли не наступать
|
Bear Постоянный участник Москва |
1. использовали свежую консервированную кровь барана; 2. Кровь разбавляли раствором Олсвера; 3. К 25 % взвеси отмытых эритроцитов (400 мл), при интенсивном перемешивании, постепенно добавляли 160 мл 50% нейтрального формалина. 4. Полученную смесь два часа грели на водяной бане 37 градусов, 5. центрифугировали 3000-4000 оборотов. 6. Отмытые физраствором эритроциты выдерживали двое суток при 4 градусах. |
Daemonarchestratygos Постоянный участник |
|
Li-Cor |
(Bear @ 03.04.2020 11:47) мы использовали такой вариант: 1. использовали свежую консервированную кровь барана; 2. Кровь разбавляли раствором Олсвера; 3. К 25 % взвеси отмытых эритроцитов (400 мл), при интенсивном перемешивании, постепенно добавляли 160 мл 50% нейтрального формалина. 4. Полученную смесь два часа грели на водяной бане 37 градусов, 5. центрифугировали 3000-4000 оборотов. 6. Отмытые физраствором эритроциты выдерживали двое суток при 4 градусах. "использовали свежую консервированную кровь барана" © видмед
|
Bear Постоянный участник Москва |
(Li-Cor @ 15.04.2020 22:55) тут нет противоречия |
Li-Cor |
(Bear @ 15.04.2020 23:17) понял |
Li-Cor |
(vb @ 01.04.2020 18:02) я формалинил эритроцыты питуха как Геном Стандарт для проточки
|
Bear Постоянный участник Москва |
Сообщение было отредактировано Bear - 15.04.2020 22:40 |
Li-Cor |
(Bear @ 15.04.2020 23:39)
|
Bear Постоянный участник Москва |
|
Li-Cor |
(Bear @ 16.04.2020 09:32) видмеды едят форел а не баранов |
Li-Cor |
(Bear @ 16.04.2020 09:32) зря царя свергнули в эпоху COVIR-19 |
IAM1688 IP-штамп: fr/1ZkUsuBQOE гость |
and arguably, more important. |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |